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방법 논문

Marsdenia tenacissima와 Ganoderma lucidum의 공동 발효 및 발효 제품의 폐암 방지 효과

1.3K 조회수

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DOI:

10.3791/64687

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2022년 12월 16일

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1School of Pharmacy, Minzu University of China, 2Ministry of Education, Key Laboratory of Ethnomedicine (Minzu University of China)

이 논문에서

요약

여기에서는 Marsdenia tenacissima (Roxb.)를 사용하여 톡 쏘는 사포닌이 풍부한 생물 변형 제품을 생산하기 위한 체계적이고 포괄적인 공동 발효 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 설명합니다. Wight et Arn. (MT) Ganoderma lucidum의 발효 매체로. 이것은 다른 민족 약물 개발을 위한 방법론적 참고 자료가 될 것입니다.

초록

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT)는 중국 전통 약초와 다이족 약초로 항염증, 항균, 항종양 특성이 있습니다. 그러나 대부분의 주요 활성 물질은 테나시제닌 A 및 테나시제닌 B와 같은 아글리콘입니다. MT의 생체이용률이 낮고 의약 활성 성분을 합성하기 어렵기 때문에 주로 생체 내 변형에 의해 연구됩니다. 본 연구는 MT를 Ganoderma lucidum (G. lucidum)의 발효 매질로 사용하여 매운 사포닌이 풍부한 생물 변형 제품을 생산하는 것을 목표로 합니다.

3가지 약용 곰팡이에 대한 예비 스크리닝을 통해 G. lucidum 및 Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis)가 일반적으로 MT의 배지에서 자랄 수 있음이 밝혀졌습니다. 따라서, 두 가지 유형의 곰팡이의 발효 효능은 폐암의 마우스 모델을 사용하여 스크리닝되었습니다. 마지막으로, 추가 조사를 위해 G. lucidum 과 MT의 동시 발효를 선택했습니다. G. lucidum co-fermentation과 함께 MT 산물에 대해 비표적 대사체학 분석을 수행했습니다. 발효 산물 에서 MT의 12가지 특정 사포닌을 확인하고 발효 산물에서 단량체 화합물인 tenacigenin A를 얻었습니다.

대부분의 테나시제닌은 테나시제닌 A와 테나시제닌 B 수치를 통해 상당한 상승 추세를 보였다. 그 결과, G. lucidum에 의한 발효 후 MT의 효능이 향상되는 것으로 나타났습니다. 또한, MT에서 C21 스테로이드 배당체의 생체 내 변환은 이 발효 과정에서 중심 반응이었습니다. 요약하면, 본 연구는 MT에 대한 체계적이고 종합적인 공동발효 시스템과 약력학 평가 방법을 확립하였으며, 이를 통해 MT의 유효활성물질의 활용도를 높였을 뿐만 아니라 다른 민족 약물 개발을 위한 방법론적 참고자료를 제공하였다.

서론

폐암은 중국 전통 의학에서 "폐 수석"의 범주에 속합니다. 폐 수석의 발병기전은 환자의 건강한 "기"의 약화, 음과 양의 불균형, 독소, 폐의 정체로 인해 폐 기능 장애, 혈액 막힘 및 폐의 체액 손실로 이어집니다. 따라서 장기간의 혈액 정체와 폐의 가래 독소는 폐 덩어리1을 형성합니다. 따라서 기를 강화하고 병원성 요인을 제거하는 것이 폐암 치료의 기본 원칙입니다. 음(陰)에 영양을 공급하여 음(陰)과 양의 균형을 잡고, 열을 제거하고, 침체를 해독 및 분산시키고, 기(氣)를 보충하고 음에 영양을 공급하고, 가래를 제거하는 방법 등이 폐 연골의 형성을 치료하고 예방하는 데 사용된다2.

Marsdenia tenacissima (MT)는 Wuguteng으로도 알려진 Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.)에 속하는 약용 식물입니다. 열을 맑게 하고 해독하는 효과가 있으며 기침과 천식을 완화하는 효과가 있으며 항종양 특성이 있습니다3. Xiaoaiping 주사, MT의 단 하나 나물에게서 한 준비는, 계속 진료소에서 널리 이용되고 계속 좋은 치료 제암성 효력을 보여줍니다4. 그러나 인구가 증가함에 따라 MT에 대한 수요가 급격히 증가했습니다. 이에 따라 야생 MT 자원의 공급이 부족하고 재배 의약품의 품질이 고르지 않습니다. 허브 재료의 낮은 품질, 성분의 불안정한 함량, 낮은 생체 이용률과 같은 문제가 있어 MT의 개발을 심각하게 위협하고 있습니다. 이러한 생체 활성 화합물 중 MT의 사포닌에 대한 조사가 활발하게 이루어졌습니다. MT에서 100개 이상의 사포닌이 확인되었습니다. 그들은 두 가지 주요 유형으로 나눌 수 있습니다 : (1) tenacissoside A-P, marsdenoside A-M, tenacigenoside A-L 및 tenacigenin A-D를 포함한 MT의 C21 스테로이드 배당체. (2) 올레아놀산(oleanolic acid) 및 우르솔산(ursolic acid)과 같은 펜타시클릭(pentacyclic) 트리테르펜. 많은 연구에서 석유 에테르 추출물의 항암 활성이 MT의 고극성 분자보다 높다는 사실이 밝혀졌습니다. 따라서 MT에서 추출한 사포닌의 주요 다당류를 생체이용률과 생체 활성이 더 높은 MT의 또 다른 작은 아글리콘으로 전환하는 것이 유리합니다5.

바이오 촉매(biocatalysis)라고도 알려진 생체 변형(biotransformation)은 생물학적 시스템에서 관련 효소를 사용하여 외인성 기질의 변형 또는 구조적 변형의 생리학적 및 생화학적 반응을 말합니다6. 이는 기존의 화학 합성보다 경제적이고 안전하며 지역적으로 선택적이며 입체 선택적이며 기존의 합성 화학 7,8로 준비하기 어려운 일부 생체 활성 화합물을 생산할 수 있습니다. 따라서 전통 한의학과 천연 의약품의 개발은 전통 중국 의학의 현대화와 국제화를 촉진하는 데 필수적입니다.

MT의 공동 발효 시스템은 생체 변형을 사용하여 구축되었습니다. 원래의 의약 재료는 미생물 효소 시스템에 의해 변형되었습니다. 한편으로는, MT의 추출물은이 모드에서 곰팡이의 발효 배양을 생산하기위한 기질로 사용되었다. 동시에 곰팡이 발효는 박테리아의 번식주기를 단축하고 생산 비용을 절감하며 생산 효율성을 향상시켰습니다 9. 반면에, 진균 발효에 의한 활성 성분의 침전이 증가하면 화학 성분이 생성되고 효능이 향상되는 것이 유익합니다10. 액체 양방향 발효 기술의 사용은 의약 재료의 활성 성분을 보호하고, 효능을 개선하고, 약물 공급원을 저장하고, 허브 재료의 활성 성분의 구조적 변형을 위한 기술을 제공함으로써 더 나은 효과를 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중국 전통 의학의 현대화 수준을 향상시키는 것은 매우 중요합니다.

본 연구에서는 문헌 검토 후 발효 미생물로 G. lucidum, O. sinensis, Inonotus obliquus (I. obliquus)를 선정하고, 해당 균주를 사전 스크리닝하였다. 그런 다음, 종양 마우스 모델을 통해 스크리닝된 균주의 효능을 탐색하여 최종 발효 균주를 결정했습니다. 마지막으로, 발효 산물의 1차 대사 산물과 2차 대사 산물을 LC-MS로 체계적으로 분석 및 평가하고, 발효 산물에서 단량체 화합물인 tenacigenin A를 얻었습니다.

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프로토콜

본 연구는 민주대학교 실험동물센터(Criminal Center of Minzu University)의 권고에 따라 수행되었다(No. ECMUC2019008AA). 이 프로토콜은 민주대학교의 실험동물윤리위원회(Experimental Animal Ethical Committee)의 승인을 받았다. MT는 윈난성 쿤밍에서 수집되었습니다.

1. 연구 준비

  1. 뜨거운 물(100°C; MT/물 = 1/10, w/v)를 30분 동안 측정하고 MT 추출 잔류물을 시험 물질로 수집합니다.
  2. 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)에서 LLC 마우스 폐암 세포주를 5%CO2 미만의 37°C의 가습 분위기에서 유지합니다.
  3. 57-8주 령, 체중 19 ± 2g의 C57BL/6J 마우스를 12시간/12시간 라이트/다크 주기와 음식과 물을 무제한으로 이용할 수 있는 환경 제어가 가능한 방에 보관하십시오. 정기적으로 소독하십시오.

2. 균주의 예비 선별 검사

  1. 멸균 기술을 사용하여 3가지 균주를 감자 포도당 한천(PDA) 고체 배지에 접종하고 28°C의 암흑 속에서 배양합니다. 접시에 곰팡이를 완전히 묻힌 후 4°C에서 보관하십시오.
  2. PDA 고체 배지에 보존된 균주를 1단계 진탕 플라스크의 종자 용액에 접종하고 28°C에서 배양하고 120rpm에서 4-5일 동안 진탕합니다. 2차 곰팡이액이 들어 있는 쉐이크 플라스크에 1단계 곰팡이액을 1:20의 부피 비율로 항온 쉐이커에 4-5일 동안 접종합니다.
  3. MT를 물로 100mg/L(MT/물)로 희석하고 한천에 용액을 첨가하여 고체 매체를 형성합니다. MT만을 함유한 고체 배양액에 3가지 균주 각각의 2차 진균액 1mL를 접종한 후 G. lucidum-MT, I. obliquus-MT 및 O. sinensis-MT 배양 시스템으로 분열합니다. 이러한 배양 시스템을 어두운 곳에서 흔들리지 않고 28°C에 두십시오.
  4. 일정 시간이 지난 후 위의 세 가지 배양 시스템에서 균주의 성장을 관찰하고 추가 스크리닝을 위해 MT에서만 성장할 수 있는 균주를 선택합니다.

3. 균주 선택 재스크리닝

참고: 예비 스크리닝 후 G. lucidum 과 O. sinensis만이 MT를 함유한 고체 배지에서 정상적으로 성장할 수 있었습니다. 항종양 효과가 우수한 시스템을 추가로 선택하기 위해, 이식된 종양 마우스 모델에서 항종양 효능을 시험하였다.

  1. G. lucidum 및 O. sinensis를 MT-MT와 G. lucidum co-fermentation(MGF) 및 MT와 O. sinensis co-fermentation(MOF)을 포함하는 액체 배지에 접종하고 180rpm에서 진탕하면서 28°C에서 10일 동안 발효합니다.
  2. 발효 후 거즈를 통해 균사체를 걸러내고 건조시킵니다. 80% 에탄올 3 x 12 h로 추출합니다.
  3. LLC 종양 세포 보유 C57BL/6J 마우스에서 발효 및 발효되지 않은 MT의 항종양 활성을 확인합니다.
    1. LLC 세포(마우스당 0.2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 1.0 ×10 6 개 세포)를 수컷 C57BL/6J 마우스(대조군 제외)의 오른쪽 측면에 피하 주입합니다.
    2. 모델의 성공적인 설정을 확인하려면 종양 결절을 터치하고 크기가 ~5mm인지 확인합니다. 종양이 있는 마우스(그룹당 n = 10)를 모델 그룹, MGF 그룹, MOF 그룹, MT 그룹 및 시스플라틴 그룹(양성 대조군)으로 무작위로 그룹화합니다. 대조군(종양 세포 없음)과 모델 그룹에 식염수를 투여합니다. 치료 14일 후 생쥐를 희생하고 종양 조직을 채취합니다.

4. 발효 제품의 화학 성분 분석

참고: 발효 효능을 검증한 후 본 연구에서 발효 균주로 G. lucidum 을 선택했습니다. 우리는 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (LC-MS) 11에 의한 MGF의 대사체학 분석을 수행했습니다.

  1. 500μL의 메탄올:H2O (7:3)와 함께 G. lucidum co-fermentation(MGF)으로 MT, G. lucidum 및 MT 10mg을 추출하고, 4°C에서 1분 동안 흔들고, 30분 동안 초음파 처리하고, 1,200 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 수집하고, 0.22μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인을 통해 여과하고, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석기 설정(LC-MS/MS)에 주입합니다.
    참고: 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 분리 대사 산물 및 품질 관리(QC) 샘플 라이브러리는 고분해능 질량 분석법으로 구성되었습니다( 재료 표 참조).
  2. 다음 UPLC 조건을 사용하십시오: C18 컬럼(100mm x 2.1mm, 8μm), 초순수 내 이동상 A-0.1%(v/v) 포름산, 이동상 B-아세토니트릴. 그래디언트 용리 프로파일을 0분 5% B로 설정합니다. 2 분 5 % B; 14 분 98% B; 17 분 98% B; 17.1 분 5% B; 20분, 0.3mL/분의 유속에서 5%
  3. high-resolution mass spectrometry를 통해 대사 산물을 검출하고 식별합니다. 컬럼 온도를 40°C로, 자동 주입기 온도를 4°C로, 주입 부피를 2μL로 설정합니다. 다음 MS 조건을 유지합니다. 전기 분무 이온 소스의 전압: +5,500/-4,500V; 커튼 가스, 이온 소스 1 및 이온 소스 2의 압력: 각각 35, 60 및 60psi; 이온 소스의 온도 : 600 °C; 해중합 전위: ± 100 V.
  4. 동일한 부피의 MT, GL 및 MGF 추출물을 혼합하여 품질 관리 샘플(QC)을 준비하고 3개의 반복실험에 각각 QC 1-3이라는 이름을 지정합니다. 동일한 단계에 따라 품질 관리 및 분석 샘플을 처리하고 감지합니다. 3개의 샘플마다 QC 샘플을 삽입하여 검출 및 분석의 반복성을 조사합니다.

5. 발효 제품의 추출 및 격리

  1. 발효 국물에서 얻은 발효 추출물을 증류수에 녹여 잘 저어줍니다.
    참고 : 여기서, 40 L의 발효 국물에서 2 kg의 발효 추출물을 얻었다.
  2. 섹션 4에서 거대다공성 흡착 수지 컬럼을 사용하여 10%, 30%, 50%, 70% 및 95% 에탄올 분획을 용리하고 분획을 수집합니다.
    참고: 여기서, 95% 에탄올 분획 10.72g, 70% 에탄올 분획 34.72g, 50% 에탄올 분획 61.57g, 30% 에탄올 분획 79.7g을 얻었다.
  3. 분획의 극성에 따라 에틸 아세테이트:메탄올 용출과 함께 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 70% 에탄올 분획을 용리하고 분획을 수집합니다.
    참고: 여기에서는 Fr. 1-Fr. 7이 수집되었습니다.
  4. Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획(여기서는 Fr. 3 및 Fr. 4)을 추가로 정제한 다음 각 분획 1.0g을 사용하여 정제 후 반분취 액상을 분리합니다.
    참고: 반분취용 액체 크로마토그래피와 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 95% 에탄올 분획을 분리하고 정제했습니다.
  5. 마이크로 분광학 및 핵 자기 공명 분광법을 수행하고 화합물의 구조를 600M 및 700M에 대한 데이터베이스의 구조와 비교하고 화합물의 평면 구조를 결정합니다.
    참고: 여기에서는 혼합물의 분자량을 측정하기 위해 하이브리드 질량 분석기를 사용했습니다. 우리는 하나의 화합물의 구조를 확인했습니다( 보충 그림 S1 참조).

6. 통계 분석

  1. 모든 발효 실험을 6 번 반복하십시오. 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가합니다. 모든 데이터를 평균 ± SD로 표현하고, 모든 실험을 세 번 반복하고, 통계적 유의성에 대해 p < 0.05로 설정합니다(*0.01 ≤ p ≤ 0.05, **0.001 ≤ p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001).
  2. SCIEX OS 소프트웨어를 사용하여 주로 질량 오류, 머무름 시간, 동위원소 일치, MS/MS 라이브러리 순도 점수 및 계산 분자 공식을 기반으로 대사 산물을 식별할 수 있습니다. 다음 라이브러리 설정 매개변수를 사용하십시오: 질량 오류 < 5ppm, 동위원소비 차이 < 20, 라이브러리 점수 > 50.

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결과

균주의 예비 선별 결과
MT와 함께 발효할 수 있는 곰팡이를 탐색하기 위해 G. lucidum, I. obliquus 및 O. sinensis의 세 가지 곰팡이를 선택했습니다. 먼저, 균주를 활성화시켰다: G. lucidum, I. obliquus 및 O. sinensis를 도 1A-C에 도시된 바와 같이 PDA 배지에 접종하고; 도 1D-F는 액상 PDA 배지에 접종한 후의 결과를 보여준다. 두 번째 단계는 2차 종자 용액의 곰팡이를 MT만 함유하는 고체 배지에 접종하는 것이었습니다. G. lucidum과 O. sinensis

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토론

균주 선별 실험 후, 우리는 모든 약용 곰팡이가 허브 물질에서 정상적으로 생존할 수 있는 것은 아니라는 것을 발견했습니다. 추가 매체가 없는 경우 약균의 생존은 필요한 탄소와 질소원을 합성하기 위해 자체 효소를 통해 의약 물질의 성분을 분해하는 데 달려 있습니다. I. obliquus 는 MT의 사포닌을 분해할 수 있는 효소를 포함하지 않을 수 있음을 추론할 수 있습니다.MT와 동시 발효될 수 있는 G. lucidum 및 O. sinensis의 경우, 두 약용 곰팡이 모두 MT를 기질로 하는 배지에서 정상적으로 자랄 수 있습니다. 발효 제품의 항종양 효과는 약물 사용에 대한 최상의 테스트입니다.

마우스 종양 모델의 확립을 통해 진균 발효 후 MT의 항종양 효과가 유의하게 향상되었음을 확인했습니다. 이로부터 약균의 발효 후 MT에서 흡수가 어렵고 극성이 높은 활성 성분이 생...

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공개 사항

저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알려진 바가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 81973977)의 보조금으로 지원되었습니다. MT 샘플은 Tongxiang-Liu 교수에 의해 식별되어 중국 민주대학교 약학대학에 보관되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AcetonitrileTonguang Fine Chemicals Company, 베이징, 중국20200923
AgarSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., 미국NO.20080107
오토클레이브BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, ChinaLS-50LD
상수 진탕 인큐베이터Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, ChinaZWY-100D
Ganoderma lucidumBeNa Culture Collection, Beijing, China31732
Inonotus obliquusBeNa Culture Collection, 베이징, 중국117822
LLC Mouse lung cancer cellNational Infrastructure of Cell Line Resource, 베이징, 중국PUMC000673
수컷 C57BL/6J 마우스Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, ChinaNo.110011210107024684
MethanolTonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China20210723
Ophiocordyceps sinensisBeNa Culture Collection, 베이징, 중국118371
Poly tetra fluoroethyleneJinteng Experiment Equipment Co., Ltd., 중국 톈징No.997
QTRAP 5500 LC/MSAB Sciex Pte. Ltd., 미국CV20231711
회전 증발기BUCHI Co., Ltd., 중국 상하이R-300
SyringeZhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, ChinaV500111
Ultra-clean benchBOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaSW-CJ-LFD

참고문헌

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