다공성 매체의 생물 막힘을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼

요약

본 프로토콜은 고해상도 현미경 이미징과 동시 압력 차이 측정을 결합하여 준 2D 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 미세 유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 다공성 매체의 공극 크기와 유체 유속이 생물 막힘에 미치는 영향을 정량화합니다.

초록

박테리아 생물막은 토양 및 여과막을 포함한 여러 환경 및 산업 다공성 매체에서 발견됩니다. 생물막은 특정 유동 조건에서 자라며 기공을 막아 국소 유체 흐름을 리디렉션할 수 있습니다. 생물막이 기공을 막는 능력, 이른바 생물막힘은 다공성 매질의 국부 투과성에 엄청난 영향을 미쳐 시스템에 압력 상승을 일으키고 이를 통과하는 질량 흐름에 영향을 줄 수 있습니다. 상이한 물리적 조건(예를 들어, 상이한 유속 및 공극 크기에서)하에서 생물막 성장과 유체 유동 사이의 상호작용을 이해하기 위해, 본 연구에서, 미세유체 플랫폼은 외부에서 부과되고 제어된 물리적 조건 하에서 현미경을 사용하여 생물막 발달을 시각화하기 위해 개발된다. 다공성 매질의 생물막 유도 압력 축적은 압력 센서를 사용하여 동시에 측정할 수 있으며, 나중에 생물막의 표면 커버리지와 상관관계가 있습니다. 제시된 플랫폼은 유동 조건에서 다공성 매체의 생물막으로 인한 생물막을 조사하기 위한 체계적인 접근 방식의 기준선을 제공하며 환경 분리주 또는 다종 생물막 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

생물막(biofilm) - 엑스트라 폴리머 물질(extra-polymeric substances, EPS)의 자가 분비 매트릭스에 포매된 박테리아 집락 - 은 토양 및 대수층¹과 같은 천연 다공성 매체와 생물 정화(bioremediation⁾², 물 여과(water filtration)³ 및 의료 기기⁽medical devices)4와 같은 기술 및 의료 응용 분야에서 흔히 볼 수 있다. 생물막 기질은 다당류, 단백질 섬유, 세포외 DNA(extracellular DNA)^5,6로 구성되어 있으며, 미생물, 영양소의 가용성^, 환경 조건에 따라 크게 좌우된다⁷. 그러나 매트릭스의 기능은 보편적입니다. 생물막 구조의 스캐폴드를 형성하고, 기계적 및 화학적 응력으로부터 미생물 군집을 보호하며, 생물막의 유변학적 특성에 크게 기여한다⁵.

다공성 매질에서 생물막의 성장은 모공을 막아 소위 생물 막....

프로토콜

1. 실리콘 웨이퍼 준비

1. CAD(Computer-Aided Design, 재료 표 참조) 소프트웨어에서 미세유체 채널의 형상을 설계하고 투명 필름에 인쇄하여 포토마스크를 만듭니다(그림 1A).
2. 아래 단계에 따라 소프트 리소그래피(클린룸 조건에서)로 마스터 몰드를 제작합니다.
   1. 실리콘 웨이퍼를 200°C에서 2시간 동안 굽습니다.
   2. 웨이퍼를 스핀 코터의 중앙에 놓고 SU8 3050 포토레지스트( 재료 표 참조)를 웨이퍼에 붓습니다. 1,700rpm에서 40초 동안 10s/100rpm 램프 시간으로 스핀 코팅합니다.
      참고: 스핀 코팅 매개변수는 SU8 3050에 대해 100μm의 목표 두께를 얻도록 설정되었습니다.
   3. 스핀 코팅 공정 후 실리콘 웨이퍼를 65°C에서 600초, 95°C에서 2,700초 동안 소프트 베이킹합니다. 웨이퍼를 실온에서 밤새 식히십시오.
      참고: 하룻밤 냉각은 웨이퍼에 대한 SU8의 접착력을 향상시킵니다.
   4. 포토마스크(단계 1.1)를 웨이퍼에 놓고 250mJ/^cm2 의 노출 에너지와 350nm의 파장으로....

결과

본 연구에서는 기공 크기가 다른 3개의 평행한 미세유체 채널을 가진 미세유체 장치를 사용하여(그림 1) 다공성 매질의 생물막 형성을 체계적으로 연구했습니다. 생물막 형성 과정은 명시야 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 박테리아 세포와 생물막은 이미지에서 더 어두운 픽셀로 나타났습니다(그림 2). 또한, 점진적인 막힘 과정이 관찰되었다. 24시간 실험 동안, 초기에 무작위로 성장한 생물막은 거의 모든 다공성 배지를 식민지화했습니다.

0.96mm/s의 평균 초기 유체 유속에 해당하는 Q = 1mL/h의 유속으로 성장한 시간에 따른 생물막의 표면 커버리지를 세 가지 다른 기공 크기(75μm, 150μm 및 300μm)에 대해 정량화했습니다(그림 3, 검은색 선). 바이오 클로깅 정도에 대한 프록시로 사용 된 .......

토론

압력 센서와 결합된 미세유체 다공성 배지 유사체는 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 데 적합한 도구를 제공합니다. 미세유체 다공성 매질 설계의 다양성, 특히 직경, 불규칙한 모양 및 기공 크기를 포함한 기둥의 배열은 많은 형상을 조사할 수 있게 해줍니다. 이러한 기하학적 구조는 단일 기공에서 다양한 자연(예: 토양) 및 산업용(예: 멤브레인 및 필터) 다공성 매체를 모방한 매우 복잡하고 불규칙하게 배열된 장애물에 이르기까지 다양합니다. 현재의 미세유체 플랫폼에서는 규칙적으로 배열된 원통형 기둥(기공 크기: 75μm, 150μm 및 300μm)을 사용하여 3개의 다공성 매체 형상을 생성했으며, 실험당 유체 유속을 선택할 수 있습니다. 제시된 플랫폼은 부과된 유체 유속이 아닌 고정된 압력 헤드로 바이오 막힘을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 경우 유량 제어 장치는 주사기 펌프 대신 배양 배지 저장소가 있는 압력 컨트롤러여야 합니다. 생물 막힘으로 인한 유속의 결과 변화는 유량 센서를 사용하여 시간 경과에 따른 유출을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acrodisc 25 mm 주사기 필터, 1.2 &마이크로; m Versapor 멤브레인	Pall Corporation	PN4190	1.2 &마이크로; m 필터
BD 10 mL 주사기 (Luer-Lock)	BD	300912	채널을 탈이온수로 채우는 데 사용됨
Box Incubator	Life Imaging Services		는 생물막 성장 실험 중에 안정적인 온도를 유지하는 데 사용됨
세포 밀도계 CO8000	WPA biowave		OD meter
원심분리기 바이알	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		주사기 펌프
CorelCAD	CorelDRAW		소프트웨어 미세유체 채널 형상 설계에 사용
배양 튜브(14mL, 멸균)	greiner bio-one		배양 튜브
건조 오븐, VENTI-Line	VWR		오븐 PDMS
Handy	Migros		세제 용액
고온 경화	플라즈마 처리 후 PDMS-유리 결합을 치료하기 위한	VRW
ImageJ	FIJI		이미지 분석 소프트웨어
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex 트랜스퍼 튜빙	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
마이크로 슬라이드, 일반, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	유리 슬라이드
미세유체 압력 센서 (1 bar)	Elveflow		압력 센서
Miltex Biopsy 펀처, 지름 1.5 mm	Integra		펀처로 미세유체 채널의 입구와 출구 구멍을 만들기 위해
mrDev600 개발자	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n° 3	Sigma Aldrich
Omnifix 주사기와 Luer-Lock	B.Braun		다양한 용량의
플라즈마 챔버 Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	PDMS와 유리 슬라이드를 플라즈마 결합하는 데 사용됩니다.
정밀 물티슈 (Kimtech Science)	슬라이드를 건조시키기 위한	Kimberly Clark	KCP-7552
Scale	VWR-CH	611-2605	엘라스토머와 가교제의 무게를 측정하는 데 사용
실리콘 웨이퍼 (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//포스 < 100> 1-10 & 오메가; cm
스핀코터, 스핀 모듈 SM150	Sawatec
SU8 3050 포토레지스트	Kayakuam
Sü ss MA6 마스크 정렬기	SUSS MicroTec Group		은 크롬 유리 마스크
Sylgard 184	Dow Corning		실리콘 엘라스토머 키트를
Techni Etch Cr01	Technic		Technic Tissue
Culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) 실란	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	규산 웨이퍼
Veeco Dektak 6개 M	Veeco		Profilometer

온도 제어 가 있는 플레이트유리 정렬하는 데 사용됩니다. 경화제 를 silanize하기 위하여 사용하는