여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 간 세포는 기능적 능력을 유지하면서 몇 주 동안 배양에서 성장할 수 있는 3차원(3D) 구조를 형성할 수 있습니다. 접착 특성이 낮거나 전혀 없는 배양 접시에 군집하는 특성으로 인해 인간 간 스페로이드라고 하는 여러 간 세포의 응집체를 형성합니다. 3D 간 스페로이드의 형성은 접착 기질이 없을 때 응집되는 간 세포의 자연적인 경향에 의존합니다. 이러한 3D 구조는 생체 내 환경에 더 가까운 세포보다 더 나은 생리적 반응을 보입니다. 3D 간세포 배양을 사용하면 생물학적으로 더 관련성이 높은 미세 환경, 자연 장기를 재조립하는 구조적 형태, 질병 상태 및 약물 에 대한 생체 내 유사 반응에 대한 더 나은 예측을 포함하여 기존의 2차원(2D) 배양과 비교할 때 많은 이점이 있습니다. 다양한 소스를 사용하여 일차 간 조직 또는 불멸화된 세포주와 같은 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 3D 간 조직은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 사용하여 간세포를 유도함으로써 조작될 수도 있습니다. 인체 막 결합 GPI 연계 단백질의 활성화에 의해 조작되지 않은 말초혈액에서 생성되고 인간 간세포로 분화된 혈액유래만능줄기세포(BD-PSC)를 이용하여 인간 간 스페로이드를 획득하였습니다. BD-PSCs 유래 인간 간 세포 및 인간 간 스페로이드를 인간 간세포 마커를 사용하여 광학 현미경 및 면역 표현형으로 분석하였다.
서론
최근 몇 년 동안 3차원(3D) 스페로이드 배양 시스템은 암 연구, 약물 발견 및 독성학의 다양한 영역을 연구하는 중요한 도구가 되었습니다. 이러한 배양은 2차원(2D) 세포 배양 단층과 복잡한 기관 사이의 간극을 메우기 때문에 큰 관심을 불러일으킨다1.
접착 표면이 없는 경우, 2D 세포 배양과 비교하여 스페로이드의 형성은 3D 형태로 클러스터링되는 이러한 세포의 자연스러운 친화력을 기반으로 합니다. 이 세포는 하나 이상의 유형의 성숙한 세포로 구성된 그룹으로 구성됩니다. 이물질이 없는 이 세포는 원래의 미세 환경에서와 같이 서로 상호 작용합니다. 3D 배양의 세포는 2D 배양보다 세포외 기질 생산이 더 높아 훨씬 더 가깝고 서로를 향한 적절한 방향을 가지며 자연 환경에 가깝습니다 2.
동물 모델은 인간의 생물학과 질병을 연구하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다3. 이와 관련하여 인간과 동물 사이에는 본질적인 차이가 있기 때문에 이러한 모델은 외계 연구에 완전히 적합하지 않습니다. 3D 배양 스페로이드 및 오가노이드는 생체 내에서 발생하는 다양한 세....
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프로토콜
이러한 실험을 수행하기 위한 윤리적 승인(ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1)을 얻었고 기관 지침에 따라 채혈 전에 모든 기증자가 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
1. 인간 말초 혈액 (PB)에서 단핵 세포 (MNC)의 제조
- 표준 프로토콜에 따라 훈련된 의료진의 도움을 받아 건강한 기증자로부터 혈액 30mL를 추출합니다.
- Becker-Kojić et al.13에 의해 발표된 프로토콜에 따라 밀도 구배 매체를 사용하여 PBMNC를 분리합니다. 피펫팅을 통해 혈장과 밀도 구배 배지 사이의 간기 층을 분리하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 분리된 세포를 세척합니다.
- 계수 챔버를 사용하고 표준 방법을 사용하여 세포 수를 계산합니다.
2. 인간 GPI 고정 당단백질로 활성화시 다국적 기업의 역분화
- 폴리스티렌 튜브(15mL)에 PBS/1% 소 혈청 알부민(BSA)에 6 x 106 개의 단핵 세포를 넣고 Becker-Kojić et
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결과
우리는 2단계 프로토콜을 적용하여 인간 BD-PSC를 내배엽/간 전구 세포와 간세포로 성공적으로 분화했습니다. 간 분화 과정 동안의 형태학적 변화는 그림 1에 나와 있습니다. BD-PSC는 세 가지 단계를 거치는 간세포로 분화됩니다. 첫 번째 단계는 내배엽 세포 L4로의 분화를 나타내고, 두 번째 단계는 전형적인 다각형 형태를 나타내는 간전구세포(hepatoblast) L8로의 분화를 나타내며, 세 번째 단계는 간세포 L15-L24로의 성숙을 나타낸다.
도 2에 제시된 바와 같이 BD-PSCs의 간 분화를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하였다. 태아 혈청의 주요 혈장 단백질인 알파-태아단백(alpha-fetoprotein, AFP)과 같은 내배엽/인간 간 전구체 마커의 강력한 발현은 성인 유기체에서 농도가 매우 낮아 간세포의 전구체15
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토론
간은 대사 산물의 해독과 같은 많은 필수 생물학적 기능을 가진 인체의 주요 기관입니다. 간경변 및/또는 바이러스성 간염과 같은 심각한 간부전으로 인해 전 세계적으로 연간 거의 200만 명이 사망합니다. 간 이식은 전 세계적으로 고형 장기 이식에서 2위를 차지하지만 현재 수요의 약 10%만이 충족됩니다22.
원발성 인간 간세포(PHH)는 종종 간 독성을 연구하는 데 사용됩니다. 이 세포는 특정 기능을 유지하면서 짧은 시간 동안 배양 상태를 유지할 수 있습니다. 또한, 단일 기증자로부터 이용 가능한 세포의 수는 제한되어 있으며, 또한 이러한 세포는 배양에서 확장 될 수 없으므로 기증자 PHH의 부족은 간독성 연구의 주요 장애물로 남아 있습니다. PSC는 인간 조직의 재생 공급원을 나타내며 3D 간 배양11의 생성에 사용될 수 있다.
간 3D 배양 시.......
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공개 사항
교신 저자는 자신이 Novel human GPI 연결 단백질과 관련된 특허 보유자임을 선언합니다. 그녀는 ACA CELL Biotech GmbH를 공동 설립하고 협력하고 있습니다. 다른 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 특히 Oksana와 John Greenacre가 제공 한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 독일 하이델베르크에 있는 ACA CELL Biotech GmbH의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알부민 항체 | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | 닭에서 생산 |
| 알부민 분획 V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | 토끼 다클론 IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | 인간 재조합 |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | 나노 크기의 자석 비즈 |
| 셀 여과기 | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | 이미징 소프트웨어 | |
| 원심분리기 튜브 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 웰 | OLS OMNI 생명 과학 | 2800-109-96 | |
| CKX53 | 올림푸스 | ||
| 시판되는 세제 | 프록터 & Gamble | 비이온 세제 | |
| CYP2E1 특이적 항체 | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | 토끼 다클론 항체 IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | 마우스 단클론 항체 IgG1 |
| 사이토케라틴 18 | DakoCytomation | M7010 | 마우스 단클론 항체 IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | 제품 생산 중단 사용 가능한 아래: TMS-013-B |
| 유리 커버 슬립 14mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-글루타민 |
| 글루타르알데히드 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| 염소 항마우스 IgG Cy3 | 항체 온라인 | ABIN1673767 | 다클론 |
| 염소 항마우스 IgG DyLight 488 | 온라인 항체 | ABIN1889284 | 다클론 |
| 염소 항토끼 IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | 간세포 성숙 배지 |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 human recombinant | |
| HNF4α 항체 | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 KSR | |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | 제품 생산 중단 카탈로그 번호 10-828-010 |
| MACS 버퍼, | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand, | Miltenyi | 130-042-303 | 마그네틱 스탠드 |
| MEM NEAA, 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS 컬럼 | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidish | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 웰 플레이트 |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 인간 재조합 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 멸균 | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml 튜브 멸균 | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit 안티 치킨 IgG 텍사스 레드 | 항체 온라인 | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| 트랜스티레틴 항체 | 그마-알드리치 | SAB3500378 | 닭에서 생산 |
| 트리톤 X-100 | 써모 피셔 사이언티픽 | HFH10 | 1% |
참고문헌
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal ....
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재인쇄 및 허가
