임신 확립은 복잡한 배아와 자궁 누화를 포함하는 역동적인 과정입니다. 이러한 과정에 대한 산모의 자궁 환경의 정확한 기여는 여전히 활발한 조사 영역으로 남아 있습니다. 여기에서는 이러한 연구 질문을 해결하기 위해 생체 내 동물 모델을 설계하는 데 도움이 되는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
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방법 논문
난소 절제된 마우스 모델에서 임신 확립에 대한 자궁 기여도를 연구하는 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
임신이 성립되려면 생존 가능한 배반포가 수용성 자궁 내막(자궁내막)과 성공적으로 상호 작용하여 착상 및 태반 형성을 촉진하고 지속적인 임신을 가능하게 해야 합니다. 배아 결함으로 인한 임신 성공의 한계는 잘 알려져 있으며 최근 수십 년 동안 체외 수정(IVF) 및 보조 생식 기술의 등장으로 크게 극복되었습니다. 그러나 아직까지 이 분야는 부적절하게 수용되는 자궁내막으로 인한 한계를 극복하지 못하여 IVF 성공률이 정체되었습니다. 난소와 자궁내막 기능은 밀접하게 얽혀 있는데, 난소에서 생성되는 호르몬이 자궁내막의 월경 주기를 담당하기 때문입니다. 따라서 설치류 임신 모델을 사용할 때 관찰 된 결과가 난소 또는 자궁 결손으로 인한 것인지 확인하기 어려울 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 배아 이식 또는 인공 탈락술을 통해 난소 절제술 마우스 모델을 개발하여 임신에 대한 자궁 특이적 기여도를 연구할 수 있도록 했습니다. 이 기사는 난소 절제술을 수행하는 방법에 대한 지침을 제공하고 건강한 기증자로부터 배아 이식 후 성공적인 인공 탈락 또는 임신을 지원하기 위해 외인성 호르몬을 공급하는 다양한 기술에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 기술에는 피하 주사, 서방성 펠릿 및 삼투압 미니 펌프가 포함됩니다. 각 방법의 주요 장점과 단점에 대해 논의하여 연구자가 특정 연구 질문에 가장 적합한 연구 설계를 선택할 수 있도록 합니다.
서론
최근 수십 년 동안 보조 생식 기술의 사용이 증가함에 따라 임신에 대한 많은 장벽이 극복되어 많은 부부가 불임 문제에도 불구하고 가정을 꾸릴 수 있게 되었습니다1. 난모세포 또는 정자 결손은 종종 체외 수정 또는 세포질 내 정자 주입을 사용하여 우회할 수 있습니다. 그러나 자궁 및 자궁내막 수용성과 관련된 문제는 생식 가능성의 파악하기 어려운 "블랙박스"로 남아 있다2.
임신은 고품질 배아가 수용성 자궁 내막 (자궁 내막)과 성공적으로 상호 작용할 때 확립됩니다. 월경 주기에 임신이 성공할 확률은 약 30%로 낮습니다.3,4. 임신 성공 사례 중 임신 20주가 지난 임신의 경우 50%-60%만이 진행되며, 임신 20주가 지나지 않은 임신의 75%는 착상 실패로 인해 발생한다3. 1990년대 후반으로 거슬러 올라가는 이러한 수치에도 불구하고 이 분야는 아직 부적절하게 수용되는 자궁내막으로 인한 한계를 극복하지 못했습니다. 이로 인해 최근 몇 년 동안 IVF 성공률이 정체되고 때로는 감소했습니다
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프로토콜
모든 동물은 온도 조절이 가능한 높은 장벽 시설(Monash University Animal Research Laboratory)에 수용되었으며 무료 음식과 물 접근이 가능하며 12시간 명암 주기가 있습니다. 모든 절차는 모나쉬 동물 연구 플랫폼 윤리 위원회(#21908, 17971)의 승인에 따라 수행되었으며, 동물 관리 및 사용에 대한 국가 보건 및 의료 연구 위원회 실행 강령에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 준비
- 절차에 필요한 모든 수술 도구, 거즈 및 종이 타월을 121°C에서 유지 시간 30분, 건조 시간 30분으로 경질/건조 제품 주기로 오토클레이브합니다.
- 수술 작업실을 위한 멸균 벤치 패드를 배치하고 진통제를 준비합니다.
- 멸균 식염수에 카프로펜을 1mg/ml로 희석하고 부피바카인을 멸균 식염수에 0.5%(w/v) 용액으로 희석합니다.
- 3.5mL 케이지 물병에 400mL의 멜록시캄을 추가합니다.
- 회복 케이지의 열 패드를 미리 예열하고 열 램프를 설치하여 회복 중인 동물에게 간접 조명을 비춥니다.
- 헤어 네트, 안면 마스크, 가운 및 장갑을 포함하여 모든 적절한 PPE를 착용했는지....
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결과
잘 특성화된 인공 탈락화 모델이 이 프로토콜 문서에 설명되어 있습니다(그림 1A). 여기서, 젊은 성인 암컷 마우스(8주령)는 섹션 1 및 섹션 2에 기재된 바와 같이 외과적 난소 절제술을 받았다. 이어서, 마우스를 2주 동안 쉬게 하여 내인성 난소 호르몬이 섹션 3-7 및 섹션 9에 기재된 바와 같이 외인성 호르몬으로 지지되기 전에 소멸되도록 하였다. 참기름의 질내 주사에 의해 인공 탈락을 유도한 다음, 동물을 섹션 9에 기재된 바와 같이 조직 수집까지 쉬게 하였다. 본 연구에서는 일반적으로 사용되는 마우스 균주인 C57BL6/J 마우스에서 인공 탈락을 수행했습니다. 조직 채취 시 체중을 기록하고 자궁을 해부하고 잘 다듬은 후 무게를 잰다(그림 1B). 탈락 반응의 정도는 자궁 중량을 체중의 비율로 표현하여 기록하였다. 이 연구에서, C57BL6/J 마우스의 80%가 탈락한 반면(0.......
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토론
이 기사는 OVX를 수행하고 임신과 생식력에 대한 자궁의 기여도를 이해하는 데 중점을 둔 연구를 위해 외인성 호르몬을 제공하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 배아 이식을 수행하고 인위적으로 탈락을 유도하는 것을 포함하여 이러한 방법의 두 가지 실험적 적용에 대해 두 가지 세부 프로토콜이 제공됩니다.
OVX를 수행하는 것은 처음에는 어려울 수 있지만, 특히 설치류 모델을 처음 접하는 연구자에게는 적절하게 훈련되고 실행되면 비교적 간단한 절차입니다. 절차의 주요 단계에는 마취 상태에서 동물을 면밀히 모니터링하고 난소 조직이 남아 있지 않은지 확인하는 것이 포함됩니다. 일부 모델에서는 난관이 손상되지 않은 채로 남아있을 수 있습니다. 그러나 난관은 풍부한 에스트로겐과 프로게스테론 수용체를 가진 호르몬 반응성 조직이라는 점에 유의해야 한다19. 난소와 난관을 제거하는 수술 프로토콜은 육안으로 완료 할 수 있기 때문에 난소 만 제거하는 .......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 또는 기타 이해 관계를 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원과 호주 정부 NHMRC(National Health and Medical Research Council) IRIISS를 통해 가능했습니다. 이 작업은 Monash Reproductive Services Platform에 액세스하기 위해 A.L.W. (Winship-PAG18-0343)에 대한 Monash University 의학, 간호 및 건강 과학 플랫폼 액세스 보조금의 지원을 받았습니다. ALW는 ARC(Australian Research Council)의 DECRA 자금 지원 DE21010037의 지원을 받습니다. JNH와 LRA는 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. L.R.A.는 Monash Graduate Excellence Scholarship의 지원을 받습니다. KJH는 ARC Future Fellowship FT190100265의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ALZET 1002 미니 삼투압 펌프 | BioScientific | 1002 | 0.25 &마이크로를 제공합니다. 14일 동안 L/h. 섹션 7(실험 절차 - 배아 이식)에 사용합니다. |
| ALZET 1003D 미니 삼투압 펌프 | BioScientific | 1003D | 는 1 &마이크로를 제공합니다. 14일 동안 L/h. 섹션 8(실험 절차 - 인공 탈이중화)에 사용합니다. |
| ALZET Reflex 7mm 클립 | BioScientific | 0009971 | 선호도에 따라 Reflex 클립 또는 Michel 클립을 상처 봉합에 사용할 수 있습니다 |
| ALZET Reflex 클립 애플리케이터 | BioScientific | 0009974 | 선호도에 따라 Reflex 클립 또는 Michel 클립을 상처 봉합에 사용할 수 |
| BioScientific | 0009976 | 리플렉스 클립 또는 미셸 클립은 선호도에 따라 상처 봉합에 사용할 수 있습니다 | |
| 부피 비카인 주사 | 화이자 | NA | 주식 0.5 %. 식염수 |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | 활성 성분 0.5 mg/mL에서 0.05%로 사용합니다. 400mL 케이지 물병당 3.5mL를 사용하거나 해당 기관의 수의사가 처방한 대로 사용하십시오. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| 다목적 실란트 | 다우 코닝 | 732 | |
| 비수술적 배아 이식(NSET) 장치 | ParaTechs | 60010 | 6mm 검경이 포함되어 있습니다. 일회용으로만 사용할 수 있습니다. |
| 프로게스테론 | 시그마 | P0130 | 에탄올에 용해됩니다. 용도 섹션 3 (호르몬 제제 - 피하 주사) 및 섹션 4 (호르몬 제제 - 서방성 펠릿) |
| 프로게스테론 | 시그마 | P7556 | 물에 용해됩니다. 섹션 5 (호르몬 제제 - 삼투압 미니 펌프) |
| 리프레시 아이 연고 | Allergan | NA | 42.5 % w / v 액체 파라핀, 57.3 % w / v 소프트 화이트 파라핀 |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | 재고 50 mg / mL. 1 mg/ml에서 사용 (5 mg/kg 용량) |
| 고무 튜브 | 다우코닝 | 508-008 | 100% 에탄올로 세척하고 1cm 조각으로 자릅니다. 내경 1.57 mm ± 0.23 밀리미터; 외부 지름 3.18mm ± 0.23 밀리미터; 벽 0.81mm. |
| 참기름 | 시그마 | S3547 | |
| Sofsilk 실크 봉합사 크기 3-0 | Covidien | GS-832 |
참고문헌
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming....
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