방법 논문

마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사

DOI:

10.3791/64765

⸱

2023년 2월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜에서 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법과 특정 세포 유형에서 태그된 핵의 분리(INTACT) 방법은 Cyp17a1-Cre 마우스 라인과 교차하는 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체와 후성유전체의 쌍을 이루는 조사에 최적화되었습니다.

초록

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세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 변화를 평가하는 것은 난소 노화를 이해하는 데 중요합니다. 이를 위해, 새로운 형질전환 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체 및 후성유전체의 후속 쌍 조사에 대해 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법 및 특정 세포 유형에서 태그된 핵 분리(INTACT) 방법의 최적화를 수행했습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 NuTRAP 발현 시스템은 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 기질 세포를 표적으로 삼았습니다. NuTRAP 구조체의 유도는 난소 기질 섬유아세포에 특이적이었고, 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA 및 RNA가 단일 난소로부터 얻어졌다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

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난소는 체세포 노화의 주요 원인이다1, 특정 세포 집단에서 뚜렷한 기여를 한다. 난소의 세포 이질성은 대량의 전체 난소 분석의 분자 결과를 해석하기 어렵게 만듭니다. 난소 노화에서 특정 세포 집단의 역할을 이해하는 것은 노인 여성의 생식 능력과 건강 감소를 담당하는 분자 동인을 식별하는 데 중요합니다. 전통적으로, 특정 난소 세포 유형에 대한 다중 오믹스 평가는 레이저 미세해부(laser microdissection)2, 단세포 접근법(single-cell approach)3 또는 세포 분류(cell sorting)4와 같은 기법으로 이루어졌다. 그러나 미세 해부는 비용이 많이 들고 수행하기 어려울 수 있으며 세포 분류는 세포 표현형 프로파일을 변경할 수 있습니다5.

난소 세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 프로파일을 평가하는 새로운 접근 방식은 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 마우스 모델을 사용합니다. NuTRAP 모델은 친화성 정제 방법인 번역 리보솜 친화성 정제(TRA....

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프로토콜

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모든 동물 시술은 오클라호마 의학 연구 재단(OMRF)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 부모 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하여 OMRF에서 14시간/10시간 명암주기(오전 6:00에 켜짐)로 HEPA 장벽 환경에서 SPF 조건에서 사육 및 사육했습니다.

참고: 이 데모에서는 Cyp17iCre+/-(균주 # 028547, 잭슨 연구소) 수컷과 NuTRAP 암컷(균주 # 029899, 잭슨 연구소)을 짝을 이룹니다. 원하는 Cyp17-NuTRAP 자손(Cyp17iCre+/-; NuTRAPflox/WT)는 난소 기질 세포에서 Cyp17a1 프로모터의 제어 하에 NuTRAP 대립유전자를 발현합니다. 본 원고 작성을 위해 생후 4개월된 암컷 Cyp17-NuTRAP 마우스(n=4)를 사용하였다. 유전자형 분석을 위해 마우스 귀 펀치 샘플에서 DNA를 추출하여 Cyp17iCre 및 NuTRAP 이식유전자의 유전을 확인하고 1) 일반 Cre, 2) Cyp17iCre 및 3) NuTRAP 플록싱의 PCR 검출을 위해앞서 설명한 바와 같이 재료 표

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결과

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TRAP 및 INTACT 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 여기에서 난소 기질/테카 세포에 대한 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성은 면역형광 이미징 및 TRAP 분리 RNA의 RNA-Seq에 의해 입증됩니다. 먼저, 난소에서 eGFP 신호의 면역형광 이미징과 theca 및 stromal 세포에 대한 eGFP 신호의 국소화를 수행했습니다. 간략하게, 5 μm 절편을 크실렌 및 에탄올 구배로 탈파라핀화하였다. 더 나은 eGFP 신호 전달을 위해 염소 항-GFP 1차 항체와 Alexa 488 당나귀 항염소 2차 항체를 사용하여 eGFP 단백질을 염색하고 핵을 DAPI15로 염색했습니다. 이미지는 형광 현미경 상에서 20x 배율로 촬영하였다(도 2A). 다음으로, 4개월령 Cyp17-NuTRAP 마우스의 난소에서 TRAP을 수행하여 테카/기질 세포에서 리보솜 결합 .......

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토론

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NuTRAP 마우스 모델6은 사용 가능한 Cre 드라이버를 사용하여 모든 세포 유형에 적용할 수 있는 특정 세포 유형에서 전사체와 후성유전체를 쌍으로 조사하기 위한 강력한 형질전환 라벨링 접근 방식입니다. 여기에서 우리는 난소 테카 및 기질 세포를 표적으로 하는 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성을 입증합니다. Cyp17-NuTRAP 모델은 난소 노화, 암 및 질병과 관련된 테카 및 기질 세포 특이적 후성유전학적 메커니즘을 추가로 설명하는 데 사용할 수 있습니다.

Cre 드라이버를 선택할 때 몇 가지 직교 접근법을 사용하여 Cre 매개 NuTRAP 발현의 세포 특이성을 검증하는 것이 좋습니다. Cyp17a1-Cre는 구성적으로 발현됩니다. NuTRAP 모델은 또한 개발 중 비표적 세포에서 유전자의 일시적인 발현을 피하기 위해 유도성 Cre 라인과 교차할 수 있습니다. 대부분의 난소 세포는 호르몬 변동에 매우 민감하기 때문에 발정.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 작업은 미국 국립보건원(NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), 브라이트포커스 재단(M2020207) 및 장로교 보건 재단의 보조금으로 지원되었다. 이 작업은 또한 미국(미국)의 MERIT 상 I01BX003906 및 공유 장비 평가 프로그램(ShEEP) 상 ISIBX004797에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재향 군인회, 생물 의학 실험실 연구 및 개발 서비스. 저자는 또한 도움과 기기 사용에 대해 임상 유전체학 센터(OMRF)와 이미징 핵심 시설(OMRF)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 M 스페르미딘시그마-알드리치05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL 시클로헥시미드시그마-알드리치C4859-1ML
2-메르캅토에탄올시그마-알드리치M3148
30 &마이크로; M 세포 스트레이너 Miltenyi Biotec130-098-458
모든 준비 DNA/RNA 미니 키트Qiagen80204
안티 GFP 항체Abcam Ab290TRAP 및 IHC(토끼 다클론에서 GFP)
버퍼 RLTQiagen79216RNA 용해 버퍼
프로토콜 cOmplete, mini, EDTA 무료 프로테아제 억제제 정제Roche11836170001TRAP 균질화를 위해 버퍼
Cyp17iCre 마우스 모델The Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 자석Invitrogen12321D
유전형 분석 프라이머IDT맞춤형일반 Cre - Jackson Laboratory 프로토콜 22392, 프라이머: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Jackson Laboratory 프로토콜 30847, 프라이머: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Jackson Laboratory 프로토콜 21509, 프라이머: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease 억제제 칵테일 (100X)Thermo Scientific1861278NPB 버퍼
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 &마이크로; m 비드 직경
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101에는 핵 용해 완충액과 핵 저장 완충액
1 m HEPESGibco15630-080
5 mNaCl Thermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP 마우스 모델The Jackson Laboratory29899B6; 129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT 중량 없음 형식Thermo ScientificA39255
단백질 G DynabeadsThermoFisher10004DTRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Heparin 나트륨Fisher ScientificBP2425
초순수 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR 튜브 로테이터Fisher ScientificNC9854190

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissect....

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NuTRAPINTACTRNA

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