방법 논문

마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사

DOI:

10.3791/64765

⸱

2023년 2월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법과 특정 세포 유형에서 태그된 핵의 분리(INTACT) 방법은 Cyp17a1-Cre 마우스 라인과 교차하는 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체와 후성유전체의 쌍을 이루는 조사에 최적화되었습니다.

초록

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세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 변화를 평가하는 것은 난소 노화를 이해하는 데 중요합니다. 이를 위해, 새로운 형질전환 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체 및 후성유전체의 후속 쌍 조사에 대해 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법 및 특정 세포 유형에서 태그된 핵 분리(INTACT) 방법의 최적화를 수행했습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 NuTRAP 발현 시스템은 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 기질 세포를 표적으로 삼았습니다. NuTRAP 구조체의 유도는 난소 기질 섬유아세포에 특이적이었고, 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA 및 RNA가 단일 난소로부터 얻어졌다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

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난소는 체세포 노화의 주요 원인이다1, 특정 세포 집단에서 뚜렷한 기여를 한다. 난소의 세포 이질성은 대량의 전체 난소 분석의 분자 결과를 해석하기 어렵게 만듭니다. 난소 노화에서 특정 세포 집단의 역할을 이해하는 것은 노인 여성의 생식 능력과 건강 감소를 담당하는 분자 동인을 식별하는 데 중요합니다. 전통적으로, 특정 난소 세포 유형에 대한 다중 오믹스 평가는 레이저 미세해부(laser microdissection)2, 단세포 접근법(single-cell approach)3 또는 세포 분류(cell sorting)4와 같은 기법으로 이루어졌다. 그러나 미세 해부는 비용이 많이 들고 수행하기 어려울 수 있으며 세포 분류는 세포 표현형 프로파일을 변경할 수 있습니다5.

난소 세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 프로파일을 평가하는 새로운 접근 방식은 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 마우스 모델을 사용합니다. NuTRAP 모델은 친화성 정제 방법인 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 및 특정 세포 유형에서 태그가 부착된 핵의 분리(INTACT)6를 사용하여 세포 분류할 필요 없이 세포 유형별 핵산을 분리할 수 있습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. NuTRAP 마우스를 세포 유형별 Cre 라인과 교차시킴으로써, STOP 카세트의 제거는 리보솜 복합체의 eGFP-태깅과 Cre-의존적 방식으로 핵의 비오틴/mCherry-태깅을 유발한다6. 그런 다음 TRAP 및 INTACT 기술을 사용하여 관심 세포 유형에서 mRNA와 핵 DNA를 분리하고 전사체 및 후성유전체 분석을 진행할 수 있습니다.

NuTRAP 모델은 지방 조직6, 뇌 조직7, 8, 9 및 망막10과 같은 다양한 조직에서 사용되어 전체 조직 균질액에서 검출되지 않을 수 있는 세포 유형별 후성유전체 및 전사체 변화를 밝혀냈습니다. 기존 세포 분류 기법에 비해 NuTRAP 접근법의 이점에는 1) 생체 외 활성화 아티팩트방지8, 2) 특수 장비(예: 세포 분류기)의 필요성 최소화, 3) 세포 유형별 분석의 처리량 증가 및 비용 절감이 포함됩니다. 또한 단일 마우스에서 세포 유형별 DNA와 RNA를 분리할 수 있는 기능을 통해 통계적 검정력을 높이는 쌍 분석이 가능합니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형 11,12,13을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 NuTRAP 발현 시스템을 기질 및 테카 세포로 표적화했습니다. 여기에서 우리는 NuTRAP 구조의 유도가 난소 기질 및 테카 세포에 특이적이며 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA와 RNA가 단일 난소에서 얻어진다는 것을 보여줍니다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 모든 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 유형 특이적 난소 NuTRAP 마우스 라인의 생성을 위해 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 대립유전자는 BirA, 비오틴 리가제 인식 펩타이드(BLRP) 태그가 지정된 mCherry/mRANGAP1 및 eGFP/L10a의 발현을 조절하는 플록싱된 STOP 코돈을 가지고 있습니다. 세포 유형별 Cre 라인과 교차할 때 NuTRAP 카세트의 발현은 핵 단백질 mRANGAP1을 비오틴/mCherry로, 리보솜 단백질 L10a를 eGFP로 Cre 의존적으로 라벨링합니다. 이를 통해 세포 분류 없이 특정 세포 유형에서 핵과 mRNA를 분리할 수 있습니다. NuTRAPflox/flox 는 난소 세포 유형과 관련된 세포 유형별 Cre와 쌍을 이루어 이를 평가할 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 동물 시술은 오클라호마 의학 연구 재단(OMRF)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 부모 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하여 OMRF에서 14시간/10시간 명암주기(오전 6:00에 켜짐)로 HEPA 장벽 환경에서 SPF 조건에서 사육 및 사육했습니다.

참고: 이 데모에서는 Cyp17iCre+/-(균주 # 028547, 잭슨 연구소) 수컷과 NuTRAP 암컷(균주 # 029899, 잭슨 연구소)을 짝을 이룹니다. 원하는 Cyp17-NuTRAP 자손(Cyp17iCre+/-; NuTRAPflox/WT)는 난소 기질 세포에서 Cyp17a1 프로모터의 제어 하에 NuTRAP 대립유전자를 발현합니다. 본 원고 작성을 위해 생후 4개월된 암컷 Cyp17-NuTRAP 마우스(n=4)를 사용하였다. 유전자형 분석을 위해 마우스 귀 펀치 샘플에서 DNA를 추출하여 Cyp17iCre 및 NuTRAP 이식유전자의 유전을 확인하고 1) 일반 Cre, 2) Cyp17iCre 및 3) NuTRAP 플록싱의 PCR 검출을 위해앞서 설명한 바와 같이 재료 표에 나열된 프라이머를 사용하여 7,8.

1. 마우스 난소 박리

  1. 동물 관리 지침 및 기관의 승인에 따라 마우스 안락사를 수행 한 후 난소 채취를 수행합니다.
  2. 완충액이 있는 튜브에 난소를 배치하기 전에 난소를 해부하여 지방 조직 또는 난소 조직에 부착될 수 있는 난관의 일부를 제거합니다. 즉시 TRAP 또는 INTACT 기술로 진행하십시오.
    참고: 이 프로토콜은 냉동 조직과 함께 사용하도록 최적화되지 않았습니다. 각 기술에 대해 동일한 마우스에서 하나의 난소를 사용하는 것이 향후 통계 분석을 위해 권장됩니다.

2. 특정 난소 세포 유형에서 핵 분리

  1. 버퍼 준비
    1. 핵 정제 완충액(NPB): NPB 100mL를 준비하기 위해 1M HEPES 2mL(최종 농도: 20mM HEPES), 5M NaCl(40mM NaCl) 0.8mL, 2M KCl(90mM KCl) 4.5mL, 0.5M EDTA(2mM EDTA) 0.4mL, 0.5M EGTA(0.5mM EGTA) 0.1mL, 및 92.2mL의 뉴클레아제가 없는 물. 핵 분리 당일 1x 프로테아제 억제제를 보충하십시오.
      참고: NPB는 프로테아제 억제제 없이 미리 제조할 수 있으며 4°C에서 최대 3주 동안 지속됩니다.
    2. 핵 용해 완충액(완전): 핵 분리 당일 1x 프로테아제 억제제로 핵 용해 완충액을 보충합니다.
  2. 핵 현탁액의 생성
    알림: samples는 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 위에 보관해야 합니다.
    1. Cyp17-NuTRAP 마우스(또는 기타 관련 Cre-NuTRAP)에서 500μL의 핵 용해 완충액(완전)에서 난소 1개를 수집합니다. 자체 개방 마이크로 가위를 사용하여 완충액 내에서 난소를 8 부분으로 자릅니다.
    2. 광구경 피펫 팁을 사용하여 다진 난소와 500μL의 용해 완충액을 얼음 위의 유리 Dounce 균질화기에 옮깁니다. 느슨한 유봉 A로 난소를 10x-20x 균질화하고 Dounce 균질화기에 용해 완충액 400μL를 추가하고 유봉 A를 세척합니다.
    3. 단단한 유봉 B 10x-20x로 난소를 균질화하십시오. 1,000 μL의 용해 완충액을 첨가하고, 유봉 B를 세척하고, 균질액(1.9 mL)을 2 mL 둥근 바닥 튜브에 옮긴다.
    4. 4°C에서 1.5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 해리되지 않은 조직과 혈관을 제거한다14. 상청액에는 핵이 포함되어 있습니다. 해리되지 않은 조직의 펠릿을 버리십시오.
    5. 100 μL의 용해 완충액으로 30 μm 세포 여과기를 미리 적신 후, 세포 여과기를 통해 상층액을 15 mL 코니컬 튜브로 여과하였다. 그런 다음 핵 함유 혼합물을 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
    6. 샘플을 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿에는 핵이 포함되어 있습니다.
    7. 250μL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액에 핵 펠릿을 중등도에서 고속으로 잠시 소용돌이치며 재현탁합니다. 용해 완충액 1.5mL를 추가하여 부피를 최대 1.75mL로 만듭니다. 부드럽게 섞고 핵 현탁액을 얼음 위에 5분 동안 둡니다.
    8. 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 핵을 펠렛화한다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 버리십시오. 200 μL의 얼음 냉장 저장 완충액에 펠릿을 재현탁하고 핵 펠릿을 완전히 재현탁하기 위해 잠시 소용돌이칩니다.
    9. 재현탁 펠릿(20μL)의 10%를 다운스트림 분석을 위한 입력 핵 샘플로 예약합니다.
    10. 재현 탁 된 핵 펠릿을 취하여 얼음처럼 차가운 NPB로 부피를 2.0mL로 구성합니다. INTACT 친화성 기반 정제 방법을 사용하여 표지된 핵을 분리합니다.
  3. 특정 세포 유형에서 태그가 지정된 핵의 분리(INTACT)
    1. 바이알에 있는 스트렙타비딘 비드를 중간 속도로 30초 동안 소용돌이쳐 완전히 재현탁되도록 합니다. 각 샘플에 대해 30μL의 재현탁 비드를 2mL 둥근 바닥 튜브에 추가하고(최대 10개의 샘플에 대한 비드는 단일 튜브에서 세척 가능) NPB 1mL를 추가하고 피펫팅으로 잘 재현탁합니다.
    2. 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 올려 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다. 세척된 마그네틱 비드를 NPB 1mL에 재현탁합니다.
    3. 총 세 번의 세척 단계를 반복합니다. 최종 세척 후, NPB의 초기 부피(샘플당 30 μL)로 비드를 재현탁한다.
    4. 세척된 비드 30μL를 단계 2.2.10의 2mL 핵 현탁액에 추가합니다. 튜브를 피펫팅하고 부드럽게 뒤집어 비드-핵 혼합물을 잘 재현탁합니다.
    5. 튜브를 냉장실이나 냉장고의 회전 믹서에 저속으로 30분 동안 놓습니다. 동일한 조건에서 비드 없이 입력 샘플을 배양합니다.
    6. 핵 현탁액과 비드가 있는 튜브를 자석에 놓고 스트렙타비딘 비드에 결합된 비오티닐화 핵(양성 분획)을 핵의 음성 분획에서 분리합니다. 비드가 자석에서 3분 동안 분리되도록 합니다.
    7. 상층액을 제거하고 음성 분획을 신선한 2.0mL 튜브에 통과시킨 다음 얼음 위에 보관합니다. 각 양성 분획 튜브에 대해 자석에서 튜브를 제거하고 내용물을 1mL의 NPB에 재현탁합니다.
    8. 튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상층액을 버립니다. 자석으로부터 튜브를 제거하고, 세척된 비드-핵 혼합물을 1 mL의 NPB에 재현탁시킨다.
    9. 총 3회 세척 위해 2.3.8단계를 반복합니다. 3회 세척 완료 후, 양성 분획 비드-핵 혼합물을 NPB 30 μL에 재현탁한다.
    10. 각각의 음성 분획 튜브에 대해, 단계 2.3.7로부터의 핵 현탁액을 4°C에서 7분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 버립니다. NPB 30μL에 음성 분획 핵 펠릿을 재현탁합니다.
    11. 핵 DNA 또는 RNA 분리가 준비될 때까지 입력(단계 2.2.9), 음성 분획(단계 2.3.10) 및 양성 분획(단계 2.3.9)의 핵을 -80°C 냉동고에 보관합니다.
      참고: 입력으로 온전한 핵을 요구하는 프로토콜(즉, 전이효소 접근 가능한 염색질, 염색질 면역침전에 대한 분석)을 위해 핵을 동결해서는 안 됩니다.

3. 특정 난소 세포 유형에서 mRNA 분리

  1. 버퍼 준비
    1. TRAP 완충액 염기: 78.8mL의 RNase가 없는 물, 5mL의 1M Tris-HCl(최종 농도: 50mM Tris[pH 7.5]), 5mL의 2M KCl(100mM KCl), 1.2mL의 1M MgCl2(12mMMgCl2) 및 10mL의 10% NP-40(1% NP-40). 4 °C에서 최대 1개월 동안 보관하세요.
    2. 고염 완충액 염기: RNase가 없는 물 68.8mL, 1M Tris-HCl 5mL(최종 농도: 50mM Tris[pH 7.5]), 2M KCl(300mM KCl) 15mL, 1M MgCl2(12mMMgCl2) 1.2mL, 10% NP-40(1% NP-40) 10mL를 혼합하여 고염 완충액 염기 100mL를 준비합니다. 4 °C에서 최대 1개월 동안 보관하세요.
    3. TRAP 균질화 완충액(완료): 조직 채취 당일 시료당 1.5mL를 준비합니다. 10mL의 TRAP 완충액 염기(3.1.1단계부터)와 10μL의 100mg/mL 시클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL 시클로헥시미드), 10mg의 나트륨 헤파린(1mg/mL 나트륨 헤파린), 20μL의 0.5M DTT(1mM DTT), 50μL의 40U/μL RNase 억제제(200U/mL RNase 억제제), 0.1M 스페르미딘(2mM 스페르미딘) 200μL 및 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 정제 1개(1x).
    4. 저염 세척 완충액(완전): 조직 채취 당일 검체당 1.5mL를 만듭니다. 10mL의 저염 세척 완충액을 만들려면 10mL의 TRAP 완충액 염기(3.1.1단계에서)와 100mg/mL 시클로헥시미드(100μg/mL 시클로헥시미드) 10μL 및 0.5M DTT(1mM DTT) 20μL를 결합합니다.
    5. 고염 세척 완충액(완료): TRAP 분리 둘째 날에 샘플당 1.5mL를 만듭니다. 10mL의 고염 세척 완충액을 만들려면 10mL의 고염 완충액 염기(3.1.2단계)와 100mg/mL 시클로헥시미드 10μL 및 0.5M DTT 20μL를 결합합니다.
  2. 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 수행
    1. Cyp17-NuTRAP 마우스(또는 기타 관련 Cre-NuTRAP)에서 다른 난소를 채취하여 100μL의 얼음처럼 차가운 TRAP 균질화 완충액이 들어 있는 1.5mL RNase가 없는 튜브에 넣습니다(3.1.3단계부터). 자체 개방 마이크로 가위를 사용하여 완충액 내에서 난소를 8 부분으로 자릅니다.
    2. 광경 팁을 사용하여 난소와 100μL의 균질화 완충액을 유리 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 느슨한 유봉 A로 10x-20x 균질화하고 400μL의 TRAP 균질화 완충액을 추가하고 유봉 A를 세척합니다.
    3. 균질액을 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 추가 1 mL의 TRAP 균질화 완충액으로 Dounce 균질화기를 세척하고, 세척된 부피를 2 mL 둥근-바닥 튜브로 옮긴다.
    4. 균질액을 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 로 원심분리합니다. 깨끗해진 상층액을 새로운 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버리십시오.
    5. 제거된 균질액 100μL를 신선한 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고 얼음에 입력으로 비축합니다.
    6. 투명하게 처리된 균질액의 나머지(단계 3.2.4)를 항-GFP 항체(5μg/mL)와 함께 4°C에서 1시간 동안 끝 위로 회전하면서 배양합니다. 동일한 조건에서 입력 샘플을 배양합니다.
    7. 인큐베이션의 마지막 15분 동안, 단백질 G 자성 비드를 저염 세척 완충액에서 다음 단계(3.2.8-3.2.11)를 사용하여 세척한다.
    8. 단백질 G 마그네틱 비드의 바이알을 30초 동안 소용돌이쳐 완전히 재현탁합니다. 각 샘플에 대해 50μL의 단백질 G 마그네틱 비드(하나의 튜브에서 최대 10개의 샘플을 세척할 수 있음)를 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
    9. 500 μL의 저염 세척 완충액을 비드에 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 넣어 튜브 측면에 비드를 모읍니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
    10. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 저염 세척 버퍼 1mL를 튜브에 추가합니다. 부드럽게 섞이도록 피펫으로 만듭니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 넣어 튜브 측면에 비드를 모읍니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
    11. 3.2.10 단계를 반복하여 총 3 번의 세척을하십시오. 최종 세척 후, 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고, 초기 부피의 저염 세척 완충액(샘플당 50 μL)에 비드를 재현탁한다.
    12. 재현탁된 세척된 비드(50 μL)를 항원 샘플/항체 혼합물로 옮기고, 종단-끝(end-over-end) 혼합기에서 회전시키면서 밤새 4°C에서 인큐베이션한다. 동일한 조건을 유지하기 위해 4°C에서 하룻밤 동안 끝에서 끝까지 회전하는 입력 샘플을 배양합니다.
    13. 하룻밤 배양 후 회전자에서 튜브를 제거하고 마그네틱 스탠드를 사용하여 2.5-3분 동안 상층액(음성 분획)에서 표적 리보솜/RNA(양성 분획)로 자성 비드를 분리합니다. 음성 분획을 흡인하고 신선한 2mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 양성 분획을 처리하는 동안 얼음 위에 따로 보관합니다.
    14. 500 μL의 고염분 세척 완충액(3.1.5 단계부터)을 양성 분획이 있는 튜브에 넣고 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 1분 동안 유지한 마그네틱 스탠드에 올려 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.
    15. 3.2.14 단계를 반복하여 총 3 회 세척합니다. 최종 세척 후, 3.5μL의 2-메르캅토에탄올(BME)로 보충된 350μL의 RNA 용해 완충액에 비드를 재현탁합니다. 디지털 셰이커에서 900rpm으로 10분 동안 혼합하면서 실온에서 튜브를 배양합니다.
    16. 표적 리보솜/RNA가 포함된 용액에서 비드를 실온에서 1분 동안 자기 스탠드로 분리합니다. 용출된 양성 분획(상청액)을 신선한 1.5mL 튜브에 수집하고 100% 에탄올 350μL를 추가합니다. 혼합하기 위해 반전합니다. RNA 분리를 진행합니다.
    17. 선택 사항: 입력 샘플(단계 3.2.5) 및 음성 분획(단계 3.2.13)에서 RNA를 분리하려면 입력 및 음성 분획 100μL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 3.5μL의 BME가 보충된 350μL의 RNA 용해 완충액을 각 샘플에 추가합니다. 혼합하기 위해 반전합니다. 각 튜브에 100% 에탄올 250μL를 넣고 뒤집어 혼합합니다. RNA 분리를 진행합니다.
  3. RNA 분리
    1. 700 μL의 양성 분획 및 선택적으로 입력 및/또는 음성 분획을 RNA 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 스핀 컬럼에서 RNA를 분리합니다.

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결과

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TRAP 및 INTACT 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 여기에서 난소 기질/테카 세포에 대한 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성은 면역형광 이미징 및 TRAP 분리 RNA의 RNA-Seq에 의해 입증됩니다. 먼저, 난소에서 eGFP 신호의 면역형광 이미징과 theca 및 stromal 세포에 대한 eGFP 신호의 국소화를 수행했습니다. 간략하게, 5 μm 절편을 크실렌 및 에탄올 구배로 탈파라핀화하였다. 더 나은 eGFP 신호 전달을 위해 염소 항-GFP 1차 항체와 Alexa 488 당나귀 항염소 2차 항체를 사용하여 eGFP 단백질을 염색하고 핵을 DAPI15로 염색했습니다. 이미지는 형광 현미경 상에서 20x 배율로 촬영하였다(도 2A). 다음으로, 4개월령 Cyp17-NuTRAP 마우스의 난소에서 TRAP을 수행하여 테카/기질 세포에서 리보솜 결합 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NuTRAP 마우스 모델6은 사용 가능한 Cre 드라이버를 사용하여 모든 세포 유형에 적용할 수 있는 특정 세포 유형에서 전사체와 후성유전체를 쌍으로 조사하기 위한 강력한 형질전환 라벨링 접근 방식입니다. 여기에서 우리는 난소 테카 및 기질 세포를 표적으로 하는 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성을 입증합니다. Cyp17-NuTRAP 모델은 난소 노화, 암 및 질병과 관련된 테카 및 기질 세포 특이적 후성유전학적 메커니즘을 추가로 설명하는 데 사용할 수 있습니다.

Cre 드라이버를 선택할 때 몇 가지 직교 접근법을 사용하여 Cre 매개 NuTRAP 발현의 세포 특이성을 검증하는 것이 좋습니다. Cyp17a1-Cre는 구성적으로 발현됩니다. NuTRAP 모델은 또한 개발 중 비표적 세포에서 유전자의 일시적인 발현을 피하기 위해 유도성 Cre 라인과 교차할 수 있습니다. 대부분의 난소 세포는 호르몬 변동에 매우 민감하기 때문에 발정...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 미국 국립보건원(NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), 브라이트포커스 재단(M2020207) 및 장로교 보건 재단의 보조금으로 지원되었다. 이 작업은 또한 미국(미국)의 MERIT 상 I01BX003906 및 공유 장비 평가 프로그램(ShEEP) 상 ISIBX004797에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재향 군인회, 생물 의학 실험실 연구 및 개발 서비스. 저자는 또한 도움과 기기 사용에 대해 임상 유전체학 센터(OMRF)와 이미징 핵심 시설(OMRF)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 M 스페르미딘시그마-알드리치05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL 시클로헥시미드시그마-알드리치C4859-1ML
2-메르캅토에탄올시그마-알드리치M3148
30 &마이크로; M 세포 스트레이너 Miltenyi Biotec130-098-458
모든 준비 DNA/RNA 미니 키트Qiagen80204
안티 GFP 항체Abcam Ab290TRAP 및 IHC(토끼 다클론에서 GFP)
버퍼 RLTQiagen79216RNA 용해 버퍼
프로토콜 cOmplete, mini, EDTA 무료 프로테아제 억제제 정제Roche11836170001TRAP 균질화를 위해 버퍼
Cyp17iCre 마우스 모델The Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 자석Invitrogen12321D
유전형 분석 프라이머IDT맞춤형일반 Cre - Jackson Laboratory 프로토콜 22392, 프라이머: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Jackson Laboratory 프로토콜 30847, 프라이머: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Jackson Laboratory 프로토콜 21509, 프라이머: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease 억제제 칵테일 (100X)Thermo Scientific1861278NPB 버퍼
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 &마이크로; m 비드 직경
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101에는 핵 용해 완충액과 핵 저장 완충액
1 m HEPESGibco15630-080
5 mNaCl Thermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP 마우스 모델The Jackson Laboratory29899B6; 129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT 중량 없음 형식Thermo ScientificA39255
단백질 G DynabeadsThermoFisher10004DTRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Heparin 나트륨Fisher ScientificBP2425
초순수 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR 튜브 로테이터Fisher ScientificNC9854190

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239(2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591(2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570(2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824(2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307(2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72(2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

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