방법 논문

변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)의 검출 및 정량화

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DOI:

10.3791/64775

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2023년 6월 16일

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1Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, 5Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, 6ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 농도와 관련된 발표된 데이터는 일관성이 없습니다. 이러한 불일치는 이 신경펩티드를 정량화하기 위한 표준화되고 검증된 방법론이 없기 때문일 수 있습니다. 여기에서는 인간 혈장에서 CGRP를 정제하고 정량화하기 위한 검증된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜을 설명합니다.

초록

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 편두통의 병태생리학에서 추정되는 역할을 하는 혈관활성 신경펩타이드이며 바이오마커 상태의 후보가 될 수 있습니다. CGRP는 활성화시 신경 섬유에서 방출되어 삼차 원심성 신경 분포를받는 혈관 구조에서 멸균 신경 인성 염증 및 동맥 혈관 확장을 유도합니다. 말초 맥관 구조에서 CGRP의 존재는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 같은 단백질체 분석을 사용하여 인간 혈장에서이 신경 펩티드를 검출하고 정량화하기위한 연구에 박차를 가했다. 그러나 6.9분의 반감기와 종종 완전히 설명되지 않은 분석 프로토콜의 기술적 세부 사항의 가변성으로 인해 문헌에서 일관되지 않은 CGRP ELISA 데이터가 생성되었습니다. 여기서, 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정량화를위한 수정 된 ELISA 프로토콜이 제시된다. 절차적 단계에는 시료 수집 및 준비, 정제 수단으로 극성 흡착제를 사용한 추출, 비특이적 결합을 차단하기 위한 추가 단계, ELISA를 통한 정량화가 포함됩니다. 또한, 이 프로토콜은 희석 실험의 스파이크 및 회수 및 선형성으로 검증되었습니다. 이 검증 된 프로토콜은 이론적으로 편두통뿐만 아니라 CGRP가 역할을 할 수있는 다른 질병이있는 개인의 혈장에서 CGRP 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 혈관주위 국소화가 있는 뉴런 섬유와 비뉴런 조직에 존재하는 37개 아미노산 뉴로펩타이드입니다. CGRP의 두 가지 형태 인 α-CGRP와 β-CGRP는 90 % 이상의 상 동성을 공유하고 생리 기능을 공유합니다. 그러나 αCGRP는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 발견되는 반면 βCGRP는 장 신경계에서 발견됩니다 1,2. 통각 수용체 활성화 및 칼슘 의존성 엑소 사이토 시스시, CGRP는 뉴런에서 방출되어 동맥 혈관 확장 및 혈장 단백질 유출을 포함하는 무균 신경 인성 염증을 유도합니다 3,4,5,6,7. 여기에서 CGRP는 모세 혈관 후 혈관에 나타나며 편두통 8,9,10,11과 같은 구 심성 통각 수용 활성화를 유발하는 질병에 대한 바이오 마커 일 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 Johns Hopkins Institutional Review Board(NA_00092491)의 승인을 받아 동의한 개인의 인간 혈장 샘플을 사용하여 개발되었습니다.

1. 시료 채취 및 준비

  1. 표준 정맥 천자 방법34를 통해 전주복 정맥에서 5mL의 전혈을 6mL 진공 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수집 튜브에 수집합니다.
  2. 표적 펩티드의 용해를 막기 위하여 수집 후에 관에 aprotinin (10,000 KIU/mL)의 aprotinin (10,000 KIU/mL) 경쟁적인 세린 프로테아제 저해제의 0.5 mL를 추가하십시오. 아프로티닌이 혈액과 적절하게 섞일 수 있도록 튜브를 10번 뒤집습니다. 그런 다음 다음 단계까지 튜브를 얼음에 보관하십시오.
  3. 혈액 수집 후 60분 이내에 4°C에서 4분 동안 튜브를 604 x g 에서 원심분리합니다.
  4. 피펫으로 혈장 분획을 제거하고 2mL 둥근 바닥 멸균 극저온 생물로 옮깁니다.
  5. 극저온 난자를 즉시 -80°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.

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결과

프로토콜에는 강조해야 할 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 세린 프로테아제 억제제 인 아프로티닌은 CGRP의 추가 효소 분해를 방지하기 위해 수집 즉시 전혈 샘플에 첨가되어야합니다. 세린 프로테아제는 CGRP 대사에 중요한 역할을하는 것으로 나타 났으며, 이전 연구에서는 인간21,35에서 CGRP를 정량화하는 데 아 프로 티닌을 사용했습니다. 프로테아제 억제제를 사용하지 않고 샘플 준비가 60 분 이상 걸리면 ELISA를 수행 할 때 CGRP 수치가 감소 할 것으로 예상 할 수 있습니다. 둘째, ELISA 이전의 고체상 추출은 용리액에 CGRP를 농축시키고 혈장 매트릭스에서 잠재적으로 간섭하는 분자를 제거합니다. 이 추출 단계는 스파이크 및 회수 실험에서 CGRP의 수율을 증가시킵니다 (다음 섹션에서 자세히 설명). 추출 후 냉장실에서의 진공 원심 분리는 CGRP의 손실을 더욱 제한합니다. 셋째, ELISA 전에 차단 .......

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토론

이 기사에서는 인간 혈장에서 CGRP의 검출 및 정량화를 허용하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상용 CGRP ELISA 키트가이 분자를 정확하게 정량화하지 못하는 것으로 밝혀진 후에 합성되었습니다. 샘플 준비 프로토콜과 유효한 표준 곡선을 확립한 후, 희석 실험의 스파이크 및 회수율 및 선형성은 회수율이 예상보다 훨씬 낮다는 것을 보여주었다. 상이한 상용 CGRP ELISA 키트를 사용하여 유사한 결과가 발견되었다(표 4). 참고로 널리 인정되는 표준 회수율은 80-120%36입니다. 이러한 결과는 CGRP에 결합하는 다른 분자 인 CGRP21,22,23,24를 분해하는 프로테아제 활성의 존재를 시사하여 플레.......

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공개 사항

저자는 더 이상 추가 할 공개가 없습니다.

감사의 글

이 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해주신 Robert N. Cole, Lauren R. DeVine, Marcos Iglesias에게 감사드립니다. 이는 미국 이비인후과 학회(Fellowship Grant, PSK), 미국 청력 연구 재단(90066548/90072266, JPC), 국립 보건원(NIH)의 구성 요소인 국립 중개 과학 발전 센터(NCATS) 및 NIH 의학 연구 로드맵(UL1 TR003098, NSF)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 출판물의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 Johns Hopkins ICTR, NCATS 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.7 mL Safeseal 마이크로 원심분리기 튜브Sorenson Bioscience, Inc.11510
99% 메탄올ThermoFisher ScientificL13255.0F
15mL 원추형 원심분리기 튜브Falcon14-959-49B
2mL 둥근 바닥 멸균 cryovialsCRYO. S122263
4% 아세트산ThermoFisher Scientific035572.K2
6.0mL Vacutainer EDTA 수집 튜브BD367863
Allegra 64R 탁상용 원심분리기Beckman Coulter, Inc.
아프로티닌VWR76344-814
CGRP(인간) ELISA 키트Bertin 바이오시약A05481
CGRP 재고Bertin 바이오시약
EIA 버퍼Bertin 바이오시약A07000
Ellman의 시약Bertin 바이오시약A09000_49+1
멀티채널 피펫ThermoFisher Scientific4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac 카트리지WatersWAT094226
Orbital ShakerBellco7744-01010
정밀 마이크로피펫ThermoFisher ScientificF144055MG
SpectraMax M 시리즈 멀티모드 마이크로플레이트 리더분자 장치부품 번호 M2
TBS/ 피셔 사이언티픽50-199-167
초순수 ELISA 등급Bertin 생물 시약A07001
진공 버섯 플러스 - 원심 분리기농축기 Eppendorf22820109
세척 버퍼Bertin 생물 시약A17000
367586

참고문헌

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and ....

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재인쇄 및 허가

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태그

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