여기에 제시된 것은 생체 외 폴리비닐 알코올 기반 확장을 사용하여 마우스 조혈 줄기 세포 배양을 시작, 유지 및 분석하는 프로토콜과 렌티바이러스 형질도입 및 전기천공을 통해 유전적으로 조작하는 방법입니다.
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방법 논문
Ex Vivo (생체 외 ) 폴리비닐 알코올 기반 배양에서 마우스 조혈 줄기 세포의 확장 및 유전자 조작
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
자가 재생 다능성 조혈 줄기 세포(HSC)는 평생 동안 조혈을 지원하고 이식 후 전체 혈액 시스템을 재구성하는 능력으로 인해 중요한 세포 유형입니다. HSC는 다양한 혈액 질환에 대한 근치적 치료를 나타내는 줄기 세포 이식 요법에 임상적으로 사용됩니다. HSC 활동과 조혈을 조절하는 메커니즘을 이해하고 새로운 HSC 기반 치료법을 개발하는 데 상당한 관심이 있습니다. 그러나 생체 외에서 HSC의 안정적인 배양과 확장은 다루기 쉬운 생체 외 시스템에서 이러한 줄기 세포를 연구하는 데 주요 장벽이었습니다. 우리는 최근 이식 가능한 마우스 HSC의 장기 및 대규모 확장을 지원할 수 있는 폴리비닐알코올 기반 배양 시스템과 이를 유전자 편집하는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입을 통해 마우스 HSC를 배양하고 유전적으로 조작하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 HSC 생물학 및 조혈에 관심이 있는 광범위한 실험적 혈액학자에게 유용할 것으로 예상됩니다.
서론
조혈 시스템은 산소 공급에서 병원균 퇴치, 특수 혈액 및 면역 세포 유형을 통해 포유류의 다양한 필수 과정을 지원합니다. 지속적인 혈액 생산(조혈)은 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에 의해 유지되는 혈액 시스템 항상성을 지원하는 데 필요합니다1. 가장 원시적인 조혈 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)로, 자가 재생 및 다계통 분화를 위한 독특한 능력을 가지고 있습니다 2,3. 이 세포집단은 주로 성인 골수에서 발견되는 희귀한 세포집단이다4, 30,000개 세포마다 약 1개의 빈도로 발생한다. HSC는 평생 조혈을 지원하고 혈액학적 스트레스 후 조혈을 재건하는 데 도움이 되는 것으로 생각됩니다. 이러한 능력은 또한 HSC가 방사선 조사를 받은 수용자에게 이식된 후 전체 조혈 시스템을 안정적으로 재구성할 수 있도록 한다5. 이는 HSC의 기능적 정의를 나타내며 다양한 혈액 및 면역 질환에 대한 치료 치료인 HSC 이식 요법의 과학적 근거를 형성합니다6. 이러한 이유로 HSC는 실험적 혈액학의 주요 초점입니다.
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프로토콜
번식 및 안락사를 포함한 모든 동물 절차는 제도적 및 국가적 지침 내에서 수행되어야 합니다. 아래에 자세히 설명된 실험은 영국 내무부의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오.
1. 원액 준비
- PVA 원액
- 작은 유리병(고압증기멸균에 적합)에 조직 배양 품질의 물 50mL를 섭취합니다. 전자레인지에 물을 거의 끓을 때까지 데웁니다.
- PVA 분말 5g의 무게를 달아 물에 첨가하십시오.
알림: PVA 1-5g만 녹이는 것이 좋습니다. 더 많은 양을 용해하면 재구성이 불완전해질 수 있습니다. - 뚜껑을 꼭 닫고 흔들어 섞어주세요. 그런 다음 뚜껑을 풉니다.
알림: 다시 열 때 수온 변화로 인해 압력이 변할 수 있으므로 주의하십시오. - 오토클레이브하고 식히십시오. 뚜껑을 꼭 닫고 흔들어 섞어주세요. 멸균 튜브에 분취량을 만들고 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.
- 동결건조된 사이토카인을 1mg/mL PVA를 함유하는 F-12 배지에 용해합니다. 줄기세포 인자를 10μg/mL로, 트롬보포이에틴을 10....
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결과
HSC의 FACS 정제를 위해 c-Kit가 풍부한 골수 내에서 세포의 ~0.2%가 어린(8-12주령) C57BL/6 마우스의 CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- 개체군일 것으로 예상합니다(그림 1). 그러나 형질전환 마우스 또는 다른 연령의 마우스는 다른 HSC 빈도를 나타낼 가능성이 있습니다. 배양 4주 후 CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- 분획은 ~10%가 될 것으로 예상합니다(그림 2). 이러한 결과는 c-Kit 농축 골수 또는 FACS 정제 HSC에서 시작된 세포 배양과 유사합니다. GFP 발현 렌티바이러스 벡터(20 transduction units/cell)로 형질도입한 후 ~.......
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토론
우리는 이 프로토콜이 HSC 생물학, 조혈 및 혈액학을 보다 일반적으로 조사하는 데 유용한 접근 방식을 제공하기를 바랍니다. FACS 정제 HSCs에 대한 PVA 기반 배양 방법의 초기 개발 8 이후, 이 방법은 확장되었다. 예를 들어, 상기 방법은 골수가 풍부한 c-Kit 및 음극 표면 대전 플레이트(14)와 함께 작동하는 것으로 나타났다. 형질도입 및 전기천공법과의 상용성도 입증되었다14,15. 이러한 HSC 및 c-Kit+ HSPC 배양의 생체 내 검증은 이 간행물에서 찾을 수 있으며, 독자는 생체 내 이식 프로토콜에 대해 공개된 다른 프로토콜을 참조할 수 있습니다21. 이식 후 신선 HSPC와 배양된 HSPC 사이의 계통 키메라에 큰 차이.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
유세포 분석에 대한 WIMM 유세포 분석 코어(Flow Cytometry Core)와 렌티바이러스 벡터 생성을 위한 WIMM 바이러스 스크리닝 코어(WIMM Virus Screening Core)에 감사드립니다. 이 연구는 Kay Kendall Leukaemia Fund와 UK Medical Research Council의 자금 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| 유봉 및 박격포 | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL 주사기 | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G 바늘 | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 &뮤; m 세포 여과기 | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μ m 세포 여과기 | 코닝 | 431751 | |
| Kimtech 닦음 | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS 열 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μ g | IDT | ||
| 동물 무함유 재조합 마우스 줄기세포 인자 | Peprotech | AF-250-03 | |
| 동물 무료 재조합 마우스 트롬보포이에틴 | Peprotech | AF-315-14 | |
| 안티-마우스 CD117 APC (클론: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| 안티-마우스 CD117 BV421 (클론: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| 안티-마우스 CD127 APC/Cy7 (클론: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| 안티-마우스 CD127 비오틴 (클론: A7R34) | 바이오레전 | 135006 | |
| 안티-마우스 CD150 PE/Cy7 (클론: TC15-12F12.2) | 바이오레전 | 드 115914 | |
| 안티-마우스 CD201 APC (클론: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| 안티-마우스 CD34 FITC (클론: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| 안티-마우스 CD4 APC/Cy7 (클론: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| 안티-마우스 CD4 비오틴 (클론: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| 안티-마우스 CD45R APC/Cy7 (클론: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| 안티-마우스 CD45R 비오틴 (클론: RA3-6B2) | 바이오레전 | 드 103204 | |
| 안티-마우스 CD48 BV421 (클론: HM48-1) | 바이오레전 | 103428 | |
| 안티-마우스 CD8 비오틴 (클론: 53-6.7) | 바이오레전 | 드 100704 | |
| 안티-마우스 CD8a APC/Cy7 (클론: 53-6.7) | 바이오레전 | 드 100714 | |
| 안티-마우스 Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (클론: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (클론: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (클론: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (클론: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| 안티-마우스 Ter119 비오틴 (클론: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND 플레이트, 24-웰 | Corning | 3337 | 음극 표면 충전 |
| CellBIND 플레이트, 96-웰 | Corning | 3330 | 음극 표면 충전 |
| 맞춤형 합성 sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | 맞춤 주문 | |
| 태아 소 혈청 | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| 피브로넥틴 코팅 플레이트, 96웰 | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 영양 혼합물 | Gibco | 11765054 | |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄-X(100x) | Gibco | 51500.056 | |
| 인산염 완충 식염수 | Alfa Aesar | J61196. AP | |
| 폴리비닐 알코올 | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Tü RKS' 솔루션 | : Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
참고문헌
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
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재인쇄 및 허가
