탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성

연골 조직 공학은 손상되거나 병든 연골 조직을 재생하기 위해 빠르게 발전하는 분야입니다¹. 이 분야의 주요 과제 중 하나는 연골 생산을 담당하는 세포인 연골세포의 성장과 분화를 지원할 수 있는 생체 모방 지지체의 개발입니다². 연골 조직의 ECM은 연골세포의 행동을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. DC-ECM은 조직 공학 응용 분야에 효과적인 비계입니다³.

연골 조직에서 DC-ECM을 생산하기 위해 화학적, 효소적, 물리적 방법을 포함한 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 생체 모방이 불충분한 ECM 하이드로겔의 생성을 초래하여 조직 공학 응용 분야에서 사용할 수 있는 잠재력을 제한합니다 ^4,5. 따라서, DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 보다 효과적인 방법이 필요하다.

이 기술의 개발은 조직 재생 및 복구를 지원할 수 있는 생체 모방 지지체를 만들기 위한 새로운 접근 방식을 제공하여 조직 공학 분야를 발전시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 또한 이 기술은 다른 조직에서 ECM 하이드로겔을 생산하는 데 쉽게 적용할 수 있어 잠재적인 응용 분야를 확장할 수 있습니다.

광범위한 문헌에서 DC-ECM을 조직 공학 응용 분야의 스캐폴드로 사용하는 것에 대한 관심이 높아지고^{있습니다 6}. 수많은 연구에서 DC-ECM 하이드로겔이 연골을 포함한 다양한 조직에서 세포 성장과 분화를 촉진하는 효과가 입증되었습니다 ^7,8. 따라서 연골 조직의 자연 ECM을 밀접하게 모방하는 DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 프로토콜의 개발은 이 분야에 상당한 기여를 하고 있습니다.

이 논문에 제시된 프로토콜은 연골 조직의 자연 ECM을 밀접하게 모방하는 DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 새로운 방법을 제공하여 이러한 요구를 해결합니다. 이 프로토콜에는 연골 조직을 탈세포화하고, 생성된 ECM을 분리하고, ECM을 생체적합성 폴리머와 가교하여 하이드로겔을 생성하는 작업이 포함됩니다. 그 결과 하이드로겔은 연골세포의 성장과 분화를 지원하는 유망한 결과를 보여주었습니다.

이 연구는 저장성 퉁덕병원 윤리위원회의 승인을 받았다.

1. DC-ECM 하이드로겔의 제조

참고: 이 연구에서 연골은 12개월 된 Bama 미니어처 돼지의 무릎 관절에서 얻어져 뼈 조직의 수집을 피했습니다.

1. 채취한 연골을 메스로 1-2mm³ 개로 잘라 차단한다.
2. 다진 연골 20g을 50mL 원심 분리 튜브에 넣고 20mL의 저긴장성 Tris-HCl 완충액 (10mM Tris-HCl, pH 8.0)을 추가하여 조직을 완전히 담그십시오. 원심분리기 튜브를 -80°C 냉동고에 3시간 동안 넣은 다음 37°C 오븐에 3시간 동안 넣습니다. 냉동 및 가열 단계를 6회 반복합니다. 이 단계에서, 저긴장성 Tris-HCl 완충액은 교체할 필요가 없다.
3. 30rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 원심분리기 튜브를 1,000초 동안 흔듭니다. 스테인리스 스틸 체(기공 크기: ~250μm)를 새 50mL 원심분리 튜브에 놓습니다.
4. 탈세포화된 연골을 스테인리스 스틸 체에 천천히 디캔팅하고 멸균 PBS로 조직을 세 번 세척하고 연골을 채취합니다.
5. 트립신 용액 10mL(PBS의 트립신 0.25%)를 넣고 튜브를 37°C의 셰이커에 24시간 동안 놓습니다. 이 기간 동안 4시간마다 트립신을 교체하십시오. 스테인리스 스틸 체를 사용하여 현탁액을 여과하고 조직을 보존합니다. 트립신은 소화 과정 중 하나에서 하룻밤 동안 치료할 수 있으며 최종 소화에 영향을 미치지 않습니다.
6. 트립신화 된 조직을 고긴장성 완충액 (1.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6)으로 세척하십시오.
7. 10mL의 뉴클레아제 용액(50mM Tris-HCl에 10U/mL 디옥시리보뉴클레아제 및 1U/mL 리보뉴클레아제 7.5)을 넣고 튜브를 37°C에서 4시간 동안 셰이커에 놓습니다.
8. 뉴클레아제 용액을 제거하고 멸균 PBS로 연골을 3회 세척하고 저긴장성 Tris-HCl 용액을 추가합니다. 원심분리기 튜브를 셰이커에 놓고 실온(RT)에서 20시간 동안 헹굽니다.
9. 저긴장성 Tris-HCl 용액을 제거하고 멸균 PBS로 연골을 세 번 세척하고 1% Triton X-100 용액을 첨가하여 조직을 24시간 동안 담그십시오.
10. Triton X-100 용액을 제거하고 탈세포화된 연골을 증류수로 3일 동안 철저히 헹구고 12시간마다 증류수를 교체합니다.
11. 연골을 과초산 용액(4% 에탄올에 0.1% PAA)에 4시간 동안 담그십시오. 과초산 용액을 제거하고 멸균 증류수로 연골을 세 번 씻습니다.
12. 스테인리스 스틸 체(기공 크기: ~250μm)를 50mL 원심분리기 튜브에 놓습니다. 탈세포화된 연골을 스테인리스 스틸 체에 천천히 넣고 연골을 모은다. DNA, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(GAG) 함량을 추정하여 연골의 탈세포화 정도와 기질 보유 정도를 테스트합니다.
13. 탈세포화된 연골을 그라인딩 볼에 넣고 액체 질소를 넣고 탈세포화된 연골을 갈아서 분말을 만듭니다. 탈세포화된 연골 분말 2g을 취하여 0.5M 아세트산 80mL와 펩신 20mg을 넣고 24시간 동안 소화합니다. 400 x g 에서 10분 동안 원심분리기; 침전물을 버리고 상층액(DC-ECM 용액)을 수집합니다.
14. 웰당 1mL의 DC-ECM 용액을 6웰 플레이트에 디캔팅합니다. 6웰 플레이트를 동결건조기에 넣습니다. DC-ECM 솔루션을 동결합니다. 동결 건조기의 온도가 -40°C로 떨어지면 진공 펌프를 켜고 진공을 10시간 동안 22Pa로 유지합니다.
15. 동결 건조된 DC-ECM 용액을 꺼내 원심분리 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다. 동결 건조 DC-ECM 용액의 최소 보관 기간은 반년을 초과합니다.
16. 멸균 증류수 1mL를 추가하여 동결 건조된 DC-ECM 용액 20mg을 원심분리 튜브에 녹입니다. RT에서 1rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 1,000분 동안 흔듭니다. DC-ECM 용액에 비타민 B2 1mg(0.1% w/v)을 넣고 37°C에서 60분 동안 배양한 후 UV 광(370nm, 3.5mW/^cm2)을 3분 동안 조사하여 하이드로겔(DC-ECM 하이드로겔)을 형성합니다.

2. 탈세포화된 연골의 검출

1. 탈세포화된 연골의 DNA 함량 검출
   참고: DNEasy Blood & Tissue Kit를 사용하여 DNA를 추출합니다.
   1. 먼저 원심분리 튜브에 DC-ECM 연골 20mg을 넣습니다. 와류 진동에 의해 180μL의 Buffer GTL과 20μL의 Proteinase K를 추가하고 연골이 완전히 용해될 때까지 56°C에서 4시간 동안 배양합니다.
   2. RT에서 15rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 원심분리기 튜브를 1,000초 동안 흔듭니다. 다음으로 200μL의 Buffer GL과 무수 에탄올을 넣고 와류 진동으로 완전히 혼합합니다. 4°C에서 6,000 x g 의 속도로 1분 동안 샘플을 원심분리합니다.
   3. 흡착 컬럼에 500μL의 버퍼 GW1을 추가하고 4°C에서 12,000 x g의 속도로 1분 동안 샘플을 원심분리합니다. 흡착 컬럼에 500μL의 버퍼 GW2를 추가하고 4°C에서 20,000 x g으로 1분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 흡착 컬럼에 멸균수 50μL를 넣고 4°C에서 6,000xg의 속도로 1분 동안 원심분리하여 DNA 용액을 수집합니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA 함량을 측정합니다.
2. 탈세포화된 연골의 콜라겐 함량 검출
   1. 탈세포화된 연골의 콜라겐 함량을 검출하려면 하이드록시프롤린을 콜라겐 아미노산 마커로 사용하십시오. 탈세포화된 연골 5mg을 100°C에서 20분 동안 6M 염산 5mL로 산성화한 다음 5mL의 6M 수산화나트륨 용액으로 중화합니다.
   2. 분광 광도계로 570nm에서 샘플의 흡광도를 측정하여 하이드록시프롤린의 함량을 계산합니다. 표준 hydroxyproline 샘플을 사용하여 농도-흡수 선형 회귀를 얻습니다.
3. 탈세포화된 연골의 GAG 함량 검출
   참고: DC-ECM 연골의 GAG 함량은 조직 GAG 비색 정량 검출 키트를 사용하여 검출되었습니다. 아래의 모든 시약은 키트에서 사용할 수 있습니다.
   1. DC-ECM 연골 분말 200mg을 취하고 와류 진동으로 시약 A 500μL를 추가합니다. 샘플을 4°C에서 16시간 동안 배양한 다음 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   2. 시료 용액 50mL를 취하여 고염 용액(시약 B) 50μL와 산성 용액(시약 C) 50μL를 와류 진동으로 첨가합니다. 샘플을 10분 동안 배양합니다.
   3. 와류 진동으로 750μL의 염료 용액(시약 D)을 추가하고 어두운 조건에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
   4. 1μL의 세척액(시약 E)을 넣고 잘 섞는다. 샘플을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   5. 1μL의 해리 용액(시약 F)을 샘플에 넣고 잘 섞습니다. 어두운 조건에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 마지막으로 600nm에서 분광 광도계를 사용하여 GAG 함량을 결정합니다.
4. 탈세포화된 연골의 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM) 분석
   1. 탈세포화된 연골과 정상 연골 조직을 비교합니다. 샘플을 2.5% 글루타르알데히드 용액에 넣고 4°C에서 밤새 배양한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.
   2. 샘플을 1% OsO4에 1시간 동안 고정한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.
   3. 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올과 100% 아세톤을 각각 15분 동안 순차적으로 담가 샘플을 탈수합니다. 샘플을 헥사메틸디실라잔과 에탄올(1:1)의 혼합 용액에 15분 동안 넣은 다음 순수한 헥사메틸디실라잔에 15분 동안 담급니다.
   4. 샘플을 HCP-2 건조기에 넣은 다음 액체 질소를 사용하여 건조시킵니다. 그런 다음 스퍼터 코팅을 사용하여 금-팔라듐의 얇은 층으로 완전히 건조된 표본을 코팅하고 SEM을 사용하여 이미지를 코팅합니다. 스퍼터 코팅은 120W의 전력으로 5분 동안 수행하였다. 실험은 15kV의 작동 전압 및 5 x 10⁻⁵ Pa보다 낮은 진공도 조건에서 수행되었습니다.
   5. TEM 분석을 위해 샘플을 무수 아세톤과 수지(1:1)의 혼합물에 1시간 동안 넣은 다음 무수 아세톤과 수지(1:3)의 혼합물을 3시간 동안 넣습니다. 그런 다음 샘플을 수지에 밤새 담그십시오.
      1. 샘플을 매립형 배지 캡슐에 넣고 70°C에서 9시간 동안 가열합니다.
      2. 매립 후 초미세 마이크로톰을 사용하여 표본을 70nm 두께로 자르고 구리 메쉬 위에 놓습니다.
      3. 20μL의 우라닐 아세테이트 염색 용액을 구리 메쉬에 피펫으로 고정하고 상온에서 15분 동안 염색합니다. 증류수로 메쉬를 부드럽게 두 번 세척하여 염색 용액을 제거합니다.
      4. 그런 다음 구연산납 염색 용액 20μL를 구리 메쉬에 피펫하고 상온에서 15분 동안 염색합니다. 증류수로 메쉬를 세 번 세척합니다.
      5. 여과지를 깐 깨끗한 페트리 접시에 구리 메쉬를 놓습니다. 자연 건조 후 TEM을 사용하여 단면을 촬영합니다. 프로브는 500nN의 하향력으로 적용되고 1Hz의 속도로 스캔되었으며 탄성 상수(k-값)는 ^40Nm-1이었습니다. 프로브 팁의 반경은 8nm로 측정되었습니다.

더 나은 DC-ECM 연골 하이드로겔을 제조하기 위해 이전 문헌을 연구 및 검토하고 탈세포화 비율, 면역원성 및 기계적 기능 측면에서 다양한 탈세포화 프로토콜을 비교했습니다9.

이를 바탕으로 DC-ECM 연골 하이드로겔을 준비하고, 골연골 결손 치료에 있어 방사형 배향 추출 매트릭스/중간엽 줄기세포 엑소좀 바이오잉크의 효과를 살펴보았습니다. 그 결과, DC-ECM 연골 하이드로겔은 면역원성이 낮고 세포 이동을 촉진하고 연골 복구를 촉진할 수 있는 것으로 나타났다10.

최근 몇 년 동안 당사는 DC-ECM 연골의 준비를 최적화했습니다. 위의 실험 단계를 사용하여 탈세포화된 연골을 준비했습니다. 그 결과, DNA 함량은 본래 연골의 DNA 함량과 비교하여 탈세포화된 연골에서 제거되었음을 보여주었습니다(p < 0.001, 그림 1A). 하이드록시프롤린 검사는 콜라겐 함량이 천연 연골과 탈세포화된 연골 간에 유사하다는 것을 나타냈습니다(p =0.48, 그림 1B). DMMB 분석은 글리코사미노글리칸이 본래 연골에 비해 탈세포화된 연골에 잘 유지됨을 보여주었습니다(p =0.68, 그림 1C). 또한 SEM과 TEM을 사용하여 DC-ECM의 미세 구조를 관찰했습니다(그림 1D).

DC-ECM 하이드로겔을 제조하기 위해, 동결 건조된 DC-ECM 용액을 최종 농도 2wt%로 가용화시켰다. 또한 DC-ECM 용액을 VB2와 혼합한 후 UVA(370nm) 유도 가교를 수행했습니다(그림 2A). DC-ECM 용액과 DC-ECM 하이드로겔을 마이크로 원심분리 튜브에 넣었습니다(그림 2B). 튜브를 뒤집었을 때 튜브의 하이드로겔이 바닥으로 흐르지 않았으며 이는 겔화의 징후였습니다. 가교제 없이 37°C에서 콜라겐 자가 조립을 기반으로 하는 DC-ECM 용액의 겔화 시간은 약 15분이었습니다(그림 2C). DC-ECM 용액 및 하이드로겔의 점도 및 동적 탄성률을 테스트하였다. DC-ECM 하이드로겔의 용액 점도가 DC-ECM 용액보다 높았으며, 전단 속도가 높을수록 용액 점도가 낮다는 것을 발견했습니다(그림 2D). 또한 DC-ECM 용액과 하이드로겔의 저장 탄성률은 손실 탄성률보다 훨씬 높았으며, 이는 둘 다 액체가 아닌 겔의 특성을 가지고 있음을 나타냅니다(그림 2E). 특히, 가교 및 동결 건조 후 SEM으로 측정한 DC-ECM 용액 및 DC-ECM 하이드로겔의 공극 크기는 137.672μm에서 37.936μm로 감소했습니다(p < 0.00195, 그림 2F,G).

그림 1: 탈세포화된 연골의 준비 및 특성화. 탈세포화된 연골은 천연 연골과 비교되었습니다. (A-C) DNA, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(GAG) 함량의 정량화. n = 5, ***p < 0.001(스튜던트 t-검정). 모든 실험은 적어도 세 번 수행되었습니다. (D) SEM 및 TEM으로 촬영한 천연 연골 및 탈세포화된 연골의 미세한 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: DC-ECM 하이드로겔의 준비 및 특성 분석. 자외선 하에서 DC-ECM 용액과 VB2가 가교되어 DC-ECM 하이드로겔을 형성했습니다. (A) DC-ECM 하이드로겔의 분자 구조 및 합성. DC-ECM 용액과 DC-ECM 하이드로겔 간의 외관, 특성화 및 기계적 특성을 비교했습니다. (B) 마이크로 원심분리기 튜브의 DC-ECM 용액 및 DC-ECM 하이드로겔의 이미지. (C) DC-ECM 하이드로겔 및 DC-ECM/VB2 하이드로겔의 겔화 시간. n = 3, ***p < 0.001(스튜던트 t-검정). (D) DC-ECM 용액 및 DC-ECM 하이드로겔의 점도 및 (E) 동적 계수. (F) DC-ECM 용액과 하이드로겔의 미세한 구조(저배율 및 고배율). 스케일 바 = 100 μm. (G) DC-ECM 용액 및 하이드로겔의 공극 크기. n = 5, ***p < 0.001(스튜던트 t-검정). 모든 실험은 적어도 세 번 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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