이 논문은 탈세포화된 연골 세포외 기질(DC-ECM) 하이드로겔의 합성을 위한 새로운 방법을 소개합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생체 적합성이 우수하고 세포 성장을 위한 우수한 미세환경을 제공합니다. 따라서 이상적인 세포 스캐폴드 및 생물학적 전달 시스템이 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
탈세포화 연골 세포외 기질(DC-ECM) 하이드로겔은 생체 적합성과 자연 조직 특성을 모방할 수 있는 능력으로 인해 조직 공학 및 재생 의학을 위한 유망한 생체 재료입니다. 이 프로토콜은 연골 조직의 기본 ECM을 밀접하게 모방한 DC-ECM 하이드로겔을 생산하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 ECM의 구조와 구성을 보존하면서 세포 물질을 제거하기 위한 물리적, 화학적 파괴와 효소 분해의 조합을 포함합니다. DC-ECM은 화학 약품을 사용하여 가교되어 안정적이고 생물학적으로 활성 하이드로겔을 형성합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생물학적 활성, 공간 구조, 생물학적 유도 기능이 우수하고 면역원성이 낮습니다. 이러한 특성은 세포 부착, 증식, 분화 및 이동을 촉진하고 세포 성장을 위한 우수한 미세환경을 조성하는 데 유용합니다. 이 프로토콜은 조직 공학 분야의 연구자와 임상의에게 귀중한 리소스를 제공합니다. 생체 모방 하이드로겔은 연골 복구 및 재생을 위한 효과적인 조직 공학 전략의 개발을 잠재적으로 향상시킬 수 있습니다.
서론
연골 조직 공학은 손상되거나 병든 연골 조직을 재생하기 위해 빠르게 발전하는 분야입니다1. 이 분야의 주요 과제 중 하나는 연골 생산을 담당하는 세포인 연골세포의 성장과 분화를 지원할 수 있는 생체 모방 지지체의 개발입니다2. 연골 조직의 ECM은 연골세포의 행동을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. DC-ECM은 조직 공학 응용 분야에 효과적인 비계입니다3.
연골 조직에서 DC-ECM을 생산하기 위해 화학적, 효소적, 물리적 방법을 포함한 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 생체 모방이 불충분한 ECM 하이드로겔의 생성을 초래하여 조직 공학 응용 분야에서 사용할 수 있는 잠재력을 제한합니다 4,5. 따라서, DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 보다 효과적인 방법이 필요하다.
이 기술의 개발은 조직 재생 및 복구를 지원할 수 있는 생체 모방 지지체를 만들기 위한 새로운 접근 방식을 제공하여 조직 공학 분야를 발전시킬 수 있기 때문에 중요합....
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프로토콜
이 연구는 저장성 퉁덕병원 윤리위원회의 승인을 받았다.
1. DC-ECM 하이드로겔의 제조
참고: 이 연구에서 연골은 12개월 된 Bama 미니어처 돼지의 무릎 관절에서 얻어져 뼈 조직의 수집을 피했습니다.
- 채취한 연골을 메스로 1-2mm3 개로 잘라 차단한다.
- 다진 연골 20g을 50mL 원심 분리 튜브에 넣고 20mL의 저긴장성 Tris-HCl 완충액 (10mM Tris-HCl, pH 8.0)을 추가하여 조직을 완전히 담그십시오. 원심분리기 튜브를 -80°C 냉동고에 3시간 동안 넣은 다음 37°C 오븐에 3시간 동안 넣습니다. 냉동 및 가열 단계를 6회 반복합니다. 이 단계에서, 저긴장성 Tris-HCl 완충액은 교체할 필요가 없다.
- 30rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 원심분리기 튜브를 1,000초 동안 흔듭니다. 스테인리스 스틸 체(기공 크기: ~250μm)를 새 50mL 원심분리 튜브에 놓습니다.
- 탈세포화된 연골을 스테인리스 스틸 체에 천천히 디캔팅하고 멸균 PBS로 조직을 세 번 세척하고 연골을 채취합니다.
- 트립신 용액 10mL(PBS의 트....
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결과
더 나은 DC-ECM 연골 하이드로겔을 제조하기 위해 이전 문헌을 연구 및 검토하고 탈세포화 비율, 면역원성 및 기계적 기능 측면에서 다양한 탈세포화 프로토콜을 비교했습니다9.
이를 바탕으로 DC-ECM 연골 하이드로겔을 준비하고, 골연골 결손 치료에 있어 방사형 배향 추출 매트릭스/중간엽 줄기세포 엑소좀 바이오잉크의 효과를 살펴보았습니다. 그 결과, DC-ECM 연골 하이드로겔은 면역원성이 낮고 세포 이동을 촉진하고 연골 복구를 촉진할 수 있는 것으로 나타났다10.
최근 몇 년 동안 당사는 DC-ECM 연골의 준비를 최적화했습니다. 위의 실험 단계를 사용하여 탈세포화된 연골을 준비했습니다. 그 결과, DNA 함량은 본래 연골의 DNA 함량과 비교하여 탈세포화된 연골에서 제거되었음을 보여주었습니다(p < 0.001,
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토론
이 프로토콜은 연골 조직의 본래 ECM을 밀접하게 모방하는 탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 제조를 위한 체계적인 접근법을 제공합니다. 이 프로토콜은 ECM의 구조와 구성을 보존하면서 세포 물질을 제거하기 위한 물리적, 화학적, 효소적 파괴의 조합을 포함합니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 탈세포화 시간 및 방법 조정과 완전한 탈세포화 보장이 포함됩니다.
조직 공학 및 재생 의학을 위한 다른 기존 방법과 비교할 때 이 프로토콜은 몇 가지 이점을 제공합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생물학적 활성, 공간구조, 생물학적 유도 기능이 우수하고 면역원성이 낮으며, 이러한 특성은 세포 부착, 증식, 분화 및 이동을 촉진하는 데 유리하다11. DC-ECM 하이드로겔은 약물 전달 및 연골 결손 치료에도 사용할 수 있다12.
이 프로토콜에 적용할 수 있는.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 절강성 의학 및 건강 기술 계획(2019KY050), 저장성 한의학 과학 기술 계획(2019ZA026), 절강성 중점 연구 개발 계획(보조금 번호 2020C03043), 절강성 한의학 과학 기술 계획(2021ZQ021), 중국 저장성 자연과학재단(LQ22H060007)의 후원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL-80 | |
| ° C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood & 조직 키트 | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG 비색 정량 감지 키트 | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 건조기 | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | 분광 광도계 |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | 주사 전자 현미경 |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | 투과 전자 현미경 |
| 스테인레스 스틸 체 | SHXB-Z-1 | 상하이 Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| 트립신 | Gibco | 15050065 | |
| 자외선 램프 | Omnicure 2000 | N/A | |
| 비타민 B2 | Gibco | R4500-5G | |
| 보텍스 믹서 | 상하이 Qiasen | 78HW-1 |
참고문헌
- Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).
- Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue e....
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