방법 논문

단백질 아르기닌 메틸화 연구: 접근법 및 방법

DOI:

10.3791/64821

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2023년 1월 20일

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Hutchinson, A., Seitova, A. Baculovirus 발현 벡터 시스템을 사용한 재조합 PRMT 단백질 생산. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), DOI: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. 글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량 분석 기반 단백질체학 접근법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (182), DOI: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. 핵 자기 공명 분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (178), DOI: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 전이효소 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (174), DOI: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. 근접 결찰 분석은 고정 조직에서 단백질 아르기닌 메틸화의 검출, 국소화 및 정량화를 가능하게 합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (185), DOI: 10.3791/64294 (2022).

사설

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단백질 아르기닌 메틸화는 광범위한 생물학적 과정의 조절에 관여하는 번역 후 변형입니다 1,2,3. 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제(PRMT) 계열의 9개 구성원은 모노메틸 및 디메틸 대칭 또는 비대칭 방식으로 아르기닌을 메틸화할 수 있습니다. 기능적 결과를 이해하고 PRMT의 메틸화 기질을 분류함으로써 PRMT 효소에 대한 이해가 극적으로 발전하고 질병과의 연관성이 촉진되었습니다2. 또한 강력하고 선택적인 억제제의 개발로 PRMT를 연구하기 위한 화학 생물학 기반 접근 방식이 가능해졌으며 PRMT 표적제의 임상 개발이 가속화되었습니다3. PRMT 분야가 발전함에 따라 새로운 방법과 그 응용을 통해 이러한 효소의 조절 및 생물학을 더욱 밝힐 수 있게 될 것입니다.

이 방법 모음에서 PRMT 단백질의 재조합 생산에 대한 기사는 바큘로바이러스 기반 발현 시스템에 대한 자세한 설명을 제공합니다4. 박테리아 발현을 사용하여 여러 PRMT를 생성할 수 있습니다. 그러나 PRMT7 또는 PRMT5와 같은 더 크거나 복잡한 종속 PRMT에는 곤충 세포 발현 시스템이 필요합니다. 이 방법은 이미 PRMT의 기질을 결정하기 위한 수많은 시험관 내 노력에 도움이 되었습니다.

세포 환경에서 PRMT 기질을 연구하려면 정교한 검출 접근 방식이 필요합니다. 이 컬렉션의 두 기사는 메틸화 아르기닌의 항체 농축에 의존하는 뚜렷한 방법론을 제시하고 질량 분석법, 정량 또는 핵 자기 공명(NMR)을 사용한 항체 독립적 정량화를 제시합니다. 뚜렷한 메틸화 상태를 인식하는 여러 항체가 개발되어 PRMT 기질을 식별하는 연구에 사용되었습니다5. 질량 분석 방법은 대사 표지, 후속 정교한 분리 기술 및 항체 기반 농축을 사용하여 세포 단백질 아르기닌 메틸화의 정량적 평가를 가능하게 합니다6. PRMT 계열의 여러 구성원은 단백질의 본질적으로 무질서한 영역에 상주하는 반복적인 RGG 모티프에서 발견되는 메틸화 아르기닌을 선호합니다7. NMR 분광법 기반 방법을 사용하면 복잡한 생물학적 샘플내에서 안정적으로 정량화할 수 있는 모든 아르기닌 유도체(모노 및 디, 대칭 및 비대칭)의 메틸화 상태와 위치를 결정할 수 있습니다8.

마지막으로, 특정 단백질에서 메틸화된 아르기닌 잔기를 식별하기 위해 두 개의 기사는 웨스턴 블로팅 및 근접 결찰 분석(PLA)을 기반으로 하는 접근 방식을 제공합니다. 이 두 가지 방법 모두 항체 기반 검출을 활용하지만 검출 방법과 제공되는 정보가 다릅니다. 웨스턴 블롯 방법은 정량적이며 화학 프로브를 특성화하는 데 유용했습니다9. PLA는 표적 단백질 항체 및 모노 또는 디-메틸 아르기닌에 대한 제네릭 항체를 사용하기 때문에 메틸화 아르기닌의 공간적 위치에 대한 정보를 제공하여 특정 항체를 생성할 필요성을 우회하고 고정 조직에 현저하게 사용할 수 있습니다10.

이러한 다양한 방법론을 통해 다양한 세포 시스템과 질병 상태에서 메틸화 아르기닌을 강력하게 발견할 수 있고 PRMT 효소의 생물학적 기능에 대한 기본 지식을 더욱 발전시킬 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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D.B.L.은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)의 지원을 받습니다. 구조 유전체학 컨소시엄(Structural Genomics Consortium)은 온타리오 유전체학 연구소(Ontario Genomics Institute)[OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA(캐나다 및 미국에서는 EMD라고도 함), Pfizer 및 Takeda를 통해 Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada로부터 기금을 받는 등록 자선 단체(번호: 1097737)입니다.

참고문헌

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  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

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Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

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