여기에서는 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠른 방법으로 원자력 현미경(AFM)의 적용을 제시하고 박테리아 크기 및 모양, 박테리아 배양 생물막, 살균제로서의 나노 입자의 활성과 같은 세부 사항을 분석합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전자 현미경은 세포 구조를 특성화하는 데 필요한 도구 중 하나입니다. 그러나 관찰을 위한 샘플 준비로 인해 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 원자력 현미경(AFM)은 3차원의 고분해능과 진공 및 시료 전도도에 대한 요구 사항이 없기 때문에 매우 유용한 특성화 기술입니다. AFM은 다양한 지형과 다양한 유형의 재료를 가진 다양한 샘플을 이미지화할 수 있습니다.
AFM은 옹스트롬 수준에서 미크론 수준까지 고해상도 3D 지형 정보를 제공합니다. 기존의 현미경과 달리 AFM은 프로브를 사용하여 샘플의 표면 지형 이미지를 생성합니다. 이 프로토콜에서는 지지체에 고정된 박테리아의 형태학적 및 세포 손상 특성 분석을 위해 이러한 유형의 현미경 사용을 제안합니다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus , ATCC 25923), 대장균( Escherichia coli , ATCC 25922) 및 슈도모나스 후나넨시스(Pseudomonas hunanensis )(마늘 구근 샘플에서 분리)의 균주를 사용하였다. 이 연구에서 박테리아 세포는 특정 배양 배지에서 성장했습니다. 세포 손상을 관찰하기 위해 황색포도상구 균과 대장균 을 서로 다른 농도의 나노입자(NP)와 함께 배양했습니다.
박테리아 현탁액 한 방울을 유리 지지대에 고정하고 AFM으로 이미지를 다른 스케일로 촬영했습니다. 얻어진 이미지는 박테리아의 형태 학적 특성을 보여 주었다. 또한, AFM을 채용하여, NPs의 효과에 의해 야기된 세포 구조의 손상을 관찰할 수 있었다. 얻어진 이미지를 기초로, 접촉 AFM은 지지체에 고정된 박테리아 세포의 형태를 특성화하는 데 사용될 수 있다. AFM은 또한 NP가 박테리아에 미치는 영향을 조사하는 데 적합한 도구입니다. 전자 현미경에 비해 AFM은 저렴하고 사용하기 쉬운 기술입니다.
서론
다른 박테리아 모양은 17 세기 Antony van Leeuwenhoek에 의해 처음 발견되었습니다1. 박테리아는 고대부터 구체에서 분지 세포에 이르기까지 매우 다양한 형태로 존재해 왔다2. 세포 모양은 박테리아 분류학자들이 각 박테리아 종을 기술하고 분류하기 위한 기본 조건으로, 주로 그람 양성 문과 그람 음성 문3의 형태학적 분리를 위한 것입니다. 박테리아 세포 형태를 결정하는 몇 가지 요소가 알려져 있으며, 이들 모두는 세포 골격뿐만 아니라 세포벽과 막의 구성 요소로서 세포 덮개 및 지지체에 관여합니다. 이런 식으로 과학자들은 박테리아 세포 형태를 결정하는 데 관련된 화학적, 생화학적, 물리적 메커니즘과 과정을 여전히 해명하고 있으며, 이 모든 것은 박테리아 모양을 정의하는 유전자 클러스터에 의해 정의됩니다 2,4.
또한 과학자들은 막대 모양이 박테리아 세포의 조상 형태일 가능성이 있음을 보여주었는데, 이는 이 세포 모양이 세포에 중요한 매개변수에서 최적으로 나타나기 때문입니다. 따라서 cocci, 나선형,....
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프로토콜
1. 박테리아 분리 및 식별
- 마늘 구근 분열 조직으로부터 endophytic 균주의 분리 :
- 이전에 껍질을 벗기고 소독하고 자른 마늘 구근의 분열조직 조각 2mm를 풍부한 성장 배지인 트립티카제 대두 한천(TSA)에 놓고 25°C에서 1일 동안 배양합니다.
- 박테리아 군집의 형태학적 차이(모양, 크기, 색상, 가장자리, 투과광, 반사광, 질감, 일관성 및 색소 생성)를 기반으로 관찰된 다양한 형태형을 설명하고 각 형태형의 대표적인 군체를 교차 줄무늬로 만들어 정제합니다.
- 정제된 모든 박테리아 균주를 -80°C에서 30% 글리세롤에 보존합니다.
- 16S rDNA를 시퀀싱하여 무작위로 선택된 균주(9AP)를 식별합니다. Hoffman과 Winston8의 방법에 따라 DNA를 추출합니다.
- 100ng의 DNA, 1x 중합효소 완충액, 4mMMgCl2, 0.4mM dNTP, 27F/1492r 범용 올리고뉴클레오티드 각각 10pmol, DNA 중합효소9 1U로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 16S rRNA를 증폭합니다. 다음과 같은 열 순환기 조건을 사용하십시오....
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결과
S. 아우레우스(S. aureus)와 P. 후나넨시스(P. hunanensis) 균주의 형태와 크기, 그리고 두 균주의 개체군 조직의 이미지는 접촉 모드에서 원자력 현미경으로 촬영되었습니다. S. aureus 이미지는 개체군이 구균 응집체가있는 구역별로 분포되어 있음을 보여주었습니다 (그림 1A). 규모가 커짐에 따라 cocci의 개체군 분포와 형태에 대한 인식이 높아졌습니다(그림 1B). 현미경 보고서에 따르면 S. aureus의 인접 세포에 유사 반구형 구조가 존재하지만 일반적으로 박테리아는 이전에 AFM 이미지에서 볼 수 있듯이 세포 분열 후 구균 형태의 구형 형태를 나타냈다. 또한, AFM 접촉 모드 이미지는 1.25 μm의 평균 폭을 나타내는 구균의 크기를 결정할 수있게 해주었다. 20개의 셀을 측정하여 얻은 값은
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토론
현미경은 생물학적 샘플의 구조, 크기, 형태 및 세포 배열을 조사할 수 있는 생물학적 실험실에서 일반적으로 사용되는 기술입니다. 이 기술을 개선하기 위해 기기의 해상도를 결정하는 광학 또는 전자적 특성 측면에서 서로 다른 여러 유형의 현미경을 사용할 수 있습니다.
과학 연구에서 박테리아 세포의 특성화를 위해서는 현미경 사용이 필요합니다. 예를 들어, 현미경 검사는 NaCl이 대장균 균주의 열 저항성과 세포 형태에 영향을 미치고, 오미자 추출물은 S. 아우레우스에 대한 항균 효과를 나타내며, S. 아우레우스는 치사 적 열 충격 후 내열성을 발달시키고, 대장균은 백금 23,24,25,26,27을 생체광물화합니다
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
Ramiro Muniz-Diaz는 장학금에 대해 CONACyT에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | 중단 | 측정 매체 |
| 세균 루프 | No aplica | 접종에 | 적합하지 않은 |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix 설치 키트 |
| Bioedit | 해당 | 없음 버전 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 분광계 | Agilent Technologies | 해당 | |
| ceftriazone | Merck | 해당 사항 없음 | 항생제 |
| 원심분리기 | Eppendorf | AFM을 방해하는 입자를 제거하는 데 | 적용되지 않음 |
| ContAI-G 실리콘 캔틸레버 | BudgetSensors | ContAl-G-10 | 측정 매체 |
| eosin 및 메틸렌 블루 한천 | Merck | 해당 사항 없음 | 박테리아 배양 배지 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | 박테리아 균주 |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA 유전자 |
| 마이크로플레이트 | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Mü ller-Hinton 국물 | Merck | 해당 없음 | 박테리아 배양 매체 |
| 영양 한천 | Merck | 해당 없음 | 박테리아 배양 매체 |
| 영양 국물 | Merck | 해당 없음 | 박테리아 배양 매체 |
| 페트리 요리 | 해당 | 없음 | 해당 없음 박테리아의 성장 |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | 해당 없음 | 없음 | 의해 마늘 전구에서 격리 |
| 마크로젠 | 해당 없음 | 염기서열분석 서비스 | |
| ScienceDesk Anti-Vibration 워크스테이션 | ThorLabs | ||
| 슬라이드 | 해당 없음 | 박테리아 시료 분석용 유리 홀더 | |
| 포도상구균 | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | 박테리아 균주 |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR 증폭 |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | 성장 매체 |
| 초음파 발생기 | Cole-Parmer 초음파 프로세서, 220VAC | 나노 입자 희석액 혼합에 | 적용 불가 |
참고문헌
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367(2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozit....
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재인쇄 및 허가
