젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅

요약

이 기사에서는 미세유체 장치를 사용한 고처리량 젤라틴 메타크릴로일 마이크로겔 제조, 마이크로젤을 부유 가능한 분말(마이크로 에어로젤)로 변환, 마이크로겔의 화학적 조립을 위한 입상 하이드로겔 스캐폴드, 3D 바이오프린팅을 위한 미세 다공성이 보존된 입상 하이드로겔 바이오잉크 개발에 대해 설명합니다.

초록

하이드로겔 미세입자(HMP) 조립을 통해 제작된 입상 하이드로겔 스캐폴드(GHS)의 출현으로 현장에서 미세 다공성 스캐폴드 형성 이 가능해졌습니다. 기존의 벌크 하이드로겔과 달리 GHS의 상호 연결된 마이크로 스케일 기공은 분해와 무관한 세포 침투와 산소, 영양소 및 세포 부산물 전달을 촉진합니다. 메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA)은 세포 접착성 및 생분해성 부분을 포함하는 (광)화학적으로 가교 가능한 단백질 기반 생체 고분자로 세포 반응성/지시성 생체 재료로 널리 사용되었습니다. 벌크 GelMA를 GHS로 전환하면 조직 공학 및 재생을 위한 많은 기회가 열릴 수 있습니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 마이크로겔 제조, 재현탁 가능한 건조 마이크로겔(마이크로 에어로젤)로의 전환, 마이크로젤의 화학적 조립을 통한 GHS 형성 및 압출 바이오프린팅을 위한 과립형 바이오잉크 제조 절차를 보여줍니다. 냉각 및 광가교를 통한 순차적인 물리화학적 처리가 기계적으로 견고한 GHS를 형성하는 방법을 보여줍니다. 빛에 접근할 수 없는 경우(예: 심부 조직 주입 중), 개별적으로 가교된 GelMA HMP는 트랜스글루타미나제를 사용한 효소 가교를 통해 생체직교적으로 조립될 수 있습니다. 마지막으로, 낮은 HMP 패킹 밀도에서 미세 다공성 GHS의 3차원(3D) 바이오프린팅은 이질적으로 하전된 나노입자의 계면 자가 조립을 통해 입증됩니다.

서론

조직 공학 스캐폴드를 형성하기 위해 HMP 빌딩 블록을 조립하는 것은^{지난 몇 년} 동안 엄청난 주목을 받았습니다1. HMP 어셈블리를 통해 제작된 GHS는 개별 빌딩 블록 사이의 빈 공간에서 발생하는 셀 규모의 미세 다공성을 포함하여 벌크 대응 제품에 비해 고유한 특성을 가지고 있습니다. 주입성, 모듈성, 다공성에서 분리된 강성과 같은 추가 특성으로 인해 GHS는 조직 복구 및 재생을 향상시키는 유망한 플랫폼이 되었습니다². 합성 PEG 기반 폴리머^3,4 및 알 지네이트⁵ 및 히알루론산 ^6,7과 같은 다당류를 포함하여 다양한 생체 재료가 GHS 제조에 사용되었습니다. 천연 유래 고분자 중에서 GHS 제조를 위한 가장 일반적인 단백질 기반 생체 고분자는 가교성, 생체적합성, 생체접착성 및 생분해성 생체재료인 GelMA 8,9,10,11 입....

프로토콜

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. GelMA 합성

알림: GelMA 합성은 화학 흄 후드에서 수행해야 하며 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.

1. 200mL의 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS, 1x)을 삼각 플라스크에 넣고 용액을 50°C에 도달할 때까지 가열합니다. 증발을 방지하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
2. 젤라틴 분말 20g을 DPBS 용액에 50°C에서 첨가하면서 분말이 완전히 용해될 때까지 240rpm으로 교반합니다.
3. 유리 파스퇴르 피펫을 통해 젤라틴 용액에 16, 2.5 또는 0.5mL의 메타크릴릴 무수물(MA)을 적가하여 각각 높은, 중간 또는 낮은 수준의 메타크릴로일 치환도를 갖는 GelMA를 합성합니다.
   주의 : MA는 유해 물질입니다. MA로 작업할 때는 적절한 PPE를 사용해야 합니다. MA는 또한 빛에 민감하므로 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 반응을 보호하십시오.
....

결과

GelMA는 그림 1A에 제시된 바와 같이 젤라틴과 MA의 반응을 통해 합성되었습니다. MA 농도와 같은 반응 조건을 조정함으로써, 상이한 MA 치환도가 얻어졌다. MA 치환 정도를 정량화하기 위해, GelMA를 1H NMR 분광법을 통해 평가하였다(도 1B). ~5-6 ppm의 화학적 이동에서 대표적인 피크를 갖는 비닐 작용기는 젤라틴으로부터 성공적인 GelMA 합성을 확인시켜 주었다. 투석 및 멸균 여과 후의 반응 수율은 >70%(GelMA mg/젤라틴 mg)였다. 액적/마이크로겔 제조 수율은 ~100%였다. 치환 정도를 정량화하기 위해 상이한 방법들이 사용될 수 있다²⁴. 우리는 라이신 아미노산(1차 아민)의 감소를 평가했으며, 식(1)에 기초하여 영향을 받지 않는 방향족 산 양성자를 사용하여 정규화했습.......

토론

젤라틴과 그 유도체는 HMP 제조에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 기반 생체 재료입니다. 처리량 대 입자 크기 단분산 절충의 문제는 스텝 유화 미세유체 장치를 사용하여 극복할 수 있습니다. 이 장치는 시간당 4천만 개 이상의 물방울을 형성할 수 있으며 변동 계수는 5%²⁷ 미만입니다. 이 기사에서는 GelMA 용액을 포함하는 액적의 미세 가공에 대해 논의한 후 GelMA HMP, 분말, GHS 및 NGB로 변환했습니다.

GelMA의 열반응성은 미세유체 지원 HMP 제조 및 안정화를 용이하게 합니다. UCST보다 높은 온도(예를 들어, 37°C)에서, GelMA는 수용액에 용해되어, 스텝-유화 장치에서 유중수 에멀젼 형성에 적합한 수성 유체를 생성한다. 온도를 낮추면(예: 4°C) 액적 형성 후 물리적 가교를 통해 GelMA HMP 형성이 가능합니다. GelMA HMP는 다양한 접근 방식을 통해 GHS 제조를 위한 빌딩 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98%
순도 생검 펀치	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1.5mm 생검 펀치(플런저 시스템 포함
무딘 바늘	SANANTS	30-002-25	25G
Bruker Avance NEO 400MHz	400MHz Bruker NEO, MA, USA		NMR 장치
원심분리기	Eppendorf, Germany	5415 C
Centrifuge tube	Celltreat, MA, 미국	229423
커피 필터	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm
OD Deuterium oxide	Sigma, MA, USA	151882
투석막 (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	건조 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 세포 배양에 적합
Erlenmeyer 플라스크	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
에탄올	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
외부 스레드 극저온 바이알 (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
동결 건조기	Labconco, MO, USA	71042000	진공 펌프 장착 (카탈로그 # 7587000)
젤라틴 분말	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	돼지 껍질의 A 형, 젤 강도 ~ 300g 블룸
유리 현미경 슬라이드	VWR, PA, USA	82027-788
핫플레이트	FOUR E'S SCIENTIFIC		5인치 마그네틱 핫플레이트 교반기 최대 온도 280°C; C/536 ° 에프
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 네거티브 포토레지스트 시리즈	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 및 KMP1035 포함
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok 커넥터	BD, NJ, 미국	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie 마스크- 및 본드 얼라인너	SÜ SS MicroTeck, 독일		나노 제조 장치
메타실레이트 무수물	Sigma, MA, USA	276685-100ML	은 2,000 를 포함합니다; 억제제로서의 ppm 토판올 A, 94%
Milli-Q water	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	전기 저항 ≈ 18 MΩ at 25 ° C, Direct-Q 5 UV 원격 정수 시스템
Novec 7500 엔지니어링 플루이드	3M, MN, USA		3M ID  7100003723
오븐	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 진공 오븐
Parafilm	Fischer scientific, MA, 미국	HS234526C
파스퇴르 피펫	VWR, PA, USA	14673-010
페트리 접시	VWR, PA, USA	25384-092	폴리스티렌
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(Novec 7500에서 5%(w/w))
피펫	VWR, PA, USA	89079-970
피펫 팁	VWR, PA, USA	87006-060
플라즈마 클리너 챔버	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
폴리디메틸실록산	다우코닝, 미시건, 미국	2065623	SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트
양성 변위 피펫	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
실리콘 웨이퍼	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4인치 기계식
등급 스파튤라	VWR, PA, USA	231-0104	일회용
SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
주사기 펌프	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon 튜빙	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
자외선	QUANS		전압 : 85 V-265 V AC / 전원 : 20 W
진공 여과 장치	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 µ m
Vortex	Fischer scientific, 미국	14-955-151	미니 볼텍스 믹서

) MI0102003