Method Article

단백질체 시료 전처리를 위한 Tips And Tricks

DOI:

10.3791/64830

⸱

February 3rd, 2023

1Department of Chemistry, Dalhousie University

In This Article

Abstract

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논의 된 기사 :

Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. FlashPack 접근 방식을 사용한 간단한 사내 초고성능 모세관 컬럼 제조. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (178), e62522 (2021).

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: 질량 분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC Class I 및 II 관련 펩타이드 분리. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (176), e63052 (2021).

Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. 오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화된 산탄총 단백질체학 시료 처리. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (176), e63092 (2021).

Nickerson, J. L. et al. 질량 분석법에 앞서 강력한 단백질체 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (180), e63503 (2022).

Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G. FDR 제어 기반 비표적 대사체에 대한 식별 및 정량화의 통합 워크플로우. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 도이: 10.3791/63625-V(2022).

Petelski, A. A., Nikolai Slavov, N., Specht, N. 동결 가열 용해 및 등압 운반체를 사용한 질량 분석 분석을 위한 단일 세포 단백질체학 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 도: 10.3791/63802 (2022).

Discussion

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감도, 속도 및 다양성이 눈에 띄게 향상된 현대 질량 분석법(MS)은 연구자에게 프로테옴 특성화를 위한 더 큰 기회를 제공합니다. 기술이 향상됨에 따라 연구자들은 결과에 더 높은 수준의 엄격함을 요구하고 있습니다. 따라서 단백질체학 워크플로우와 동등하게 중요한 것은 MS보다 먼저 복잡한 단백질체 혼합물을 분리, 분리 및 처리하기 위해 고안된 혁신적인 시료 전처리 전략입니다. 단백질체 시스템의 화학적 다양성은 시료 준비에 대한 '일률적인' 접근 방식을 배제합니다. 그러나 이 방법 수집을 통해 볼 수 있듯이 MS 데이터의 품질과 신뢰도를 극대화하기 위해 여러 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 컬렉션은 연구자에게 단백질체 및 대사체 워크플로의 예상 결과를 향상시키기 위해 설계된 구현하기 쉬운 도구와 요령을 제공하는 것을 목표로 합니다.

모세관 HPLC 및 UPLC 컬럼은 포괄적인 단백질체학 워크플로우에 거의 유비쿼터스입니다. 자체 충전 모세관 컬럼은 상업용 컬럼에 대한 저렴한 대안이지만, 자체 컬럼을 포장하려고 시도한 사람들은 일관되지 않은 충전 속도와 다양한 컬럼 품질에 익숙할 수 있습니다. 러시아 과학 아카데미의 Kovalchuk과 동료들은 UPLC 모세관 컬럼의 효율적이고 일관된 패킹을 보장하기 위한 FlashPack 접근 방식을 시연합니다1. 정밀하게 제어되는 변수의 조합은 모세관 입구에서 큐폴라 형성을 줄이고 저압 패킹 폭탄을 사용하여 신속한 컬럼 충전을 가능하게 합니다.

면역펩티체학은 종양학 및 면역 요법에 임상적 의미를 지닌 단백질체학의 새로운 하위 분야입니다. 신뢰할 수 있는 MS 분석을 위해서는 MHC 클래스 I/II 또는 인간 백혈구 항원(HLA) 펩타이드 리간드의 분리가 필요합니다. 이 분리 프로토콜의 재현성을 개선하기 위해 몬트리올 대학의 Sirois와 동료들은 회수된 면역펩티돔2의 예상 MS 결과와 함께 소규모 비드 기반 친화성 캡처 워크플로우를 시연합니다.

단백질체학 데이터의 엄격성을 더욱 개선하고 많은 수의 샘플에 대한 고처리량 처리를 용이하게 하기 위해 연구자들은 샘플 처리 단계를 자동화하기 위해 점점 더 로봇 플랫폼으로 전환하고 있습니다. 저가형 로봇 플랫폼을 사용할 수 있지만, 이를 위해서는 사용자가 원하는 조작 단계를 프로그래밍해야 하며, 이는 이 장치를 사용하는 데 장벽이 될 수 있습니다. 콜로라도 대학교 Anschutz Medical Campus의 Han et al. 간단한 오픈 소스 코딩 패키지를 고안하고 Opentrons OT-2 로봇 플랫폼3에서 단백질 소화와 관련된 기본 단계를 시연했습니다.

SDS와 같은 계면활성제는 MS에 앞서 세포 추출 및 프로테옴 가용화를 촉진하기 위해 일반적으로 사용됩니다. 그러나 SDS 제거가 불완전하거나 샘플 손실의 위험이 있습니다. Dalhousie University의 Nickerson과 동료들은 단백질 침전 과정을 자동화하는 일회용 카트리지를 시연합니다4. 소금과 유기 용매의 조합은 단백질 회수를 극대화하는 데 중요하며 최소한의 시간 내에 높은 수율로 수행할 수 있습니다.

대사체학은 프로테옴 분석의 발자취를 따르고 있으며, 표적 및 비표적 워크플로우에서 알려지지 않은 대사산물을 식별하는 데 사용되는 참조 MS 스펙트럼 데이터베이스가 증가하고 있습니다. 단백질체학 분석과 유사하게 스펙트럼 식별은 위양성 일치가 발생하기 쉽기 때문에 낮은 신뢰도 결과를 필터링하려면 잘못된 발견률(FDR)에 대한 통계적 보고가 필수적입니다. 지난 대학의 Li와 동료들은 Chi-Biotech Co.와 협력하여 XY-Meta 프로그램을 기반으로 웹 기반 워크플로를 생성하고 대사 산물의 표적 미끼 데이터베이스를 생성했습니다5. 그들은 대상 데이터베이스를 생성하고 원하는 FDR을 기반으로 대사체 결과를 필터링하는 단계를 보여줍니다.

마지막으로, 단일 세포 프로테옴 분리를 위한 프로토콜은 Northeastern University6의 Petelski와 동료들에 의해 시연되었습니다. SCoPE2(Single-Cell ProtEomics) 프로토콜을 통해 연구자들은 시료 손실을 줄이기 위해 동압 담체를 사용하여 단일 실험에서 수백에서 수천 개의 단백질을 정량화할 수 있습니다. 프로토콜의 핵심은 세포를 용해하기 위한 신속한 열 순환 단계와 TMT 태그가 있는 일반보다 많은 양의 효소 및 동압 라벨링을 사용하는 효율적인 트립스 소화입니다.

단백질체학 분야에서 수십 년의 경험에도 불구하고 이 성숙한 분야는 단순히 더 어려운 문제를 해결하기 위해 발전했습니다. 데이터 출력에 대한 일관성과 신뢰성을 높여 더 많은 수의 샘플 또는 더 적은 양의 재료를 처리할 수 있는 능력은 계속해서 기술 혁신을 주도하고 있습니다. 화학 조작, 도구 및 정보학 접근 방식과 관련된 아이디어 교환은 이 분야의 성장에 필수적입니다. 한 연구자의 '문제'는 문제를 극복하기 위한 간단한 '팁이나 요령'으로 이미 해결되었을 수 있습니다. 따라서 프로테옴 분석을 위한 고유한 전략이 너무 많다는 것은 긍정적인 신호입니다. 남아 있는 과제에 대해서는 누군가가 이미 가능한 해결책을 모색하고 있을 가능성이 높습니다.

Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, NSERC RGPIN 05145-17)의 지원을 받았습니다.

References

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  1. Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the FlashPack approach. Journal of Visualized Experiments. (178), e62522(2021).
  2. Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of mouse and human MHC Class I- and II-associated peptides for mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (176), e63052(2021).
  3. Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. Shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot. Journal of Visualized Experiments. (176), e63092(2021).
  4. Nickerson, J. L., et al. Organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (180), e63503(2022).
  5. Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G. An integrated workflow of identification and quantification on FDR control-based untargeted metabolome. Journal of Visualized Experiments. , e63625(2022).
  6. Petelski, A. A., Nikolai Slavov, N., Specht, N. Single-cell proteomics preparation for mass spectrometry analysis using freeze-heat lysis and an isobaric carrier. Journal of Visualized Experiments. , e63802(2022).

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