환자 유래 오가노이드(PDO)는 시험관 내에서 종양 환경을 모방할 수 있는 3차원(3D) 배양물입니다. 고급 장액성 난소암에서 PDO는 새로운 바이오마커 및 치료제를 연구하기 위한 모델을 나타냅니다.
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방법 논문
고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
오가노이드는 환자 유래 난소 종양 조직, 복수 또는 흉수에서 성공적으로 성장할 수 있는 3D 동적 종양 모델이며 난소암에 대한 새로운 치료법 및 예측 바이오마커의 발견을 돕습니다. 이 모델은 클론 이질성, 종양 미세 환경, 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 요약합니다. 또한, 그들은 형태학적으로, 세포학적으로, 면역조직화학적으로, 유전적으로 원발성 종양과 일치하는 것으로 나타났습니다. 따라서 오가노이드는 종양 세포 및 종양 미세 환경에 대한 연구를 용이하게 하며 세포주보다 우수합니다. 현재 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 종양, 복수 및 흉막액 샘플에서 환자 유래 난소암 오가노이드를 생성하는 고유한 방법을 설명합니다. 환자 샘플은 기계적 및 효소 분해에 의해 세포 현탁액으로 분리됩니다. 그런 다음 기저막 추출물(BME)을 사용하여 세포를 도말하고 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 배양에 특이적인 보충제를 포함하는 최적화된 성장 배지로 지지합니다. 초기 오가노이드를 형성한 후 PDO는 후속 실험을 위한 확장을 위한 계대배양을 포함하여 장기간 배양을 지속할 수 있습니다.
서론
2021년에 미국에서 약 21,410명의 여성이 상피성 난소암 진단을 받았고 12,940명의 여성이 이 질병으로 사망했습니다1. 수술과 화학요법이 충분히 발전했음에도 불구하고, 진행성 질환 환자의 70% 이상이 화학요법 내성이 나타나 진단 후 5년 이내에 사망한다 2,3. 따라서 이 치명적인 질병을 치료하기 위한 새로운 전략과 전임상 연구를 위한 대표적이고 신뢰할 수 있는 모델이 시급히 필요합니다.
원발성 난소 종양에서 생성된 암 세포주와 환자 유래 이종이식(PDX)은 난소암 연구에 사용되는 주요 도구입니다. 암 세포주의 주요 장점은 빠른 확장입니다. 그러나 이들의 지속적인 배양은 암 세포주가 원래의 원발성 암 종양 샘플에서 벗어나게 하는 표현형 및 유전형 변화를 초래합니다. 암 세포주와 원발성 종양 사이의 기존 차이로 인해, 세포주에서 긍정적인 영향을 미치는 약물 분석은 임상 시험에서 동일한 효과를 나타내지 못한다2. 이러한 한계를 극복하기 위해 PDX 모델이 사용됩니다. 이 모델은 신선한 난소암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 만들어집니다.
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프로토콜
연구를 위해 수집된 모든 인체 조직 표본은 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 아래에 요약된 프로토콜은 멸균 인체 조직 배양 환경에서 수행되었습니다. 정보에 입각한 서면 동의는 인간 피험자로부터 얻었습니다. 적격 환자는 난소암 진단 또는 추정 진단을 받았고, 정보에 입각한 동의서에 서명할 의지와 능력이 있어야 하며, 18세 이상이어야 했습니다. 종양 조직(악성 원발성 종양 또는 전이 부위), 복수 및 흉막액은 시술 당시 동의한 환자로부터 얻었습니다. 이 표본은 즉시 실험실로 운반되어 아래에 설명된 방법을 사용하여 오가노이드 생성을 위해 처리되었습니다.
1. 매체 준비
- 완벽한 오가노이드 배지 준비
- 이전에 발표된 보고서7에 따라 R-spondin 1/Noggin 조절 배지를 준비합니다.
참고: R-spondin-1/Noggin 조절 배지는 상업적으로 이용 가능한 재조합 단백질에 대한 보다 저렴한 대안입니다. 렌티바이러스 매개 형질도입을 통해 R-스폰딘-1 및 노긴을 안정적으로 분비하는 HEK293T 세포는 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교 의과대학의 Ron Bose....
- 이전에 발표된 보고서7에 따라 R-spondin 1/Noggin 조절 배지를 준비합니다.
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결과
PDO를 생성하기 위해, 샘플을 기계적 및 효소적으로 단일 세포 현탁액으로 분해하였다. 그런 다음 세포를 BME에 재현탁하고 특별히 조작된 배지로 보충했습니다(그림 3). 오가노이드는 일반적으로 10일의 기간 동안 확립되며, 그 후 배양에서 개별 오가노이드를 입증합니다(그림 4).
그림 3: 오가노이드로 형성된.......
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토론
난소암은 진단 시 진행 단계와 화학 요법 내성의 일반적인 발달로 인해 매우 치명적입니다. 난소암 연구의 많은 발전은 암 세포주와 PDX 모델을 활용하여 이루어졌습니다. 그러나 보다 대표적이고 저렴한 시험관 내 모델에 대한 분명한 필요성이 있습니다. PDO는 원발성 종양의 종양 이질성, 종양 미세환경, 게놈 및 전사체적 특징을 정확하게 나타내는 것으로 입증되었으며, 따라서 약물 요법에서 오가노이드 모델의 구현과 같은 다양한 연구 접근법을 위한 이상적인 전임상 모델이다16.
여기에 설명된 프로토콜은 97%의 성공률로 알 수 있듯이 매우 효과적이고 신뢰할 수 있습니다. 현재 프로토콜에는 세심한 주의를 기울여야 하는 중요한 단계가 있음을 강조하는 것이 중요합니다. 첫째, 조직에서 오가노이드를 채취할 때 샘플이 완전히 균질화되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 해리 프로그램을 두 번 이상 실행해야 할 수 있습니다. 샘플.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로토콜을 수립하는 데 있어 Ron Bose, MD, PhD의 지도와 Barbara Blachut, MD의 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 세인트루이스 산부인과 및 부인과 종양학과에 있는 워싱턴 대학교 의과대학, 워싱턴 대학교 학장 장학생 프로그램 및 생식 과학자 개발 프로그램에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% 페니실린-스트렙토마이신 | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10cm 조직 배양 접시 | TPP | 93100 | |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | |||
| 100 &마이크로; m 세포 여과기 | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL 분리기 관 | Corning | 430052 | |
| 2 mL 극저온 | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% 파라포름알데히드 고정액 | 시그마-알드리치 | ||
| 37 ° C 수조 | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 컨디셔닝 미디어 보충제 | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6웰 플레이트 | TPP | 92006 | |
| 70% 에탄올 | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| 원심분리기 | |||
| 컬트렉스 타입 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | 기저막 추출물 |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I 반응 버퍼 | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C 튜브 | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| 히터가 있는 gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | 우리는 제조업체 프로토콜을 사용합니다. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | 디펩타이드, L-알라닐-L-글루타민 |
| 헤마톡실린 및 에오신 염색 키트 | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast 파라핀 왁스 | Fisher Scientific | 22900700 | |
| 마이크로 원심분리기 | |||
| Mr. Frosty 냉동 컨테이너 | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-아세틸시스테인 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 니코틴아미드 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 피펫 팁 포함 | |||
| p200 피펫(팁 포함) | |||
| 파스퇴르 피펫 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | 피셔 사이언티픽 | MT21031CM | |
| 피펫 컨트롤러 | |||
| 프로스타글란딘 E2 | R& D 시스템 | 2296 | |
| 퓨로마이신 | ThermoFisher | A1113802 | |
| 재조합 쥐 Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 회수 세포 배양 냉동 매체 | Invitrogen | 12648010 | |
| 적혈구 용해 완충액 | BioLegend | 420301 | |
| ROCK 억제제 (Y-27632) | R& D 시스템 | 1254/1 | |
| SB202190 | 시그마-알드리치 | S7076 | |
| T75 플라스크 | MidSci | TP90076 | |
| 조직 배양 후드 | |||
| 조직 임베딩 카세트 | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | 동물 유래 성분 무함유, 재조합 효소 |
| 유형 II 콜라겐분해효소 Life | Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
참고문헌
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organ....
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