면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화

난소암은 부인과 악성 종양으로 인한 주요 사망 원인입니다. 대다수의 환자는 카보플라틴과 같은 DNA 손상 약물로 치료받으며, 상동 재조합 복구(HRR) 결핍 종양이 있는 환자에게는 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제를 투여할 수 있다 ^1,2. 그러나 대부분의 환자는 이러한 요법에 내성이 생기고 진단 후 5년 이내에 사망합니다. DNA 손상 반응(DDR)의 조절장애는 난소암의 발생과 화학요법 및 PARP 억제제 내성 둘 다와 연관되었다³. 따라서 DDR에 대한 연구는 난소암의 병태생리학, 잠재적인 바이오마커 및 새로운 표적 치료법을 이해하는 데 필수적입니다.

DDR을 평가하는 현재의 방법은 면역형광법(IF)을 활용하는데, 이를 통해 DNA 손상 단백질과 뉴클레오티드 유사체의 정확한 식별 및 국소화가 가능합니다. DNA에 이중 가닥 절단(DSB)이 생기면 히스톤 단백질 H2AX가 빠르게 인산화되어 DNA 손상 복구 단백질이 모이는 초점을 형성합니다⁴. 이러한 인산화는 IF를 이용하여 쉽게 확인할 수 있다; 사실, ɣ-H2AX 분석은 일반적으로 DSB ^5,6,7,8,9의 유도를 확인하는 데 사용되었습니다. 증가된 DNA 손상은 백금 감수성 및 DNA 손상제의 효능과 관련이 있으며^10,11,12, ɣ-H2AX는 다른 암 치료에서 화학요법 반응과 관련된 바이오마커로 제안되었다 ¹³. DSB에서 HRR에 능숙한 세포는 BRCA1 및 BRCA2가 복제 단백질 A(RPA)를 대체하고 DNA에 결합하기 위해 RAD51을 모집하도록 하는 일련의 이벤트를 수행합니다. HRR 복구는 DNA 템플릿을 사용하여 DSB를 충실하게 복구합니다. 그러나 종양에 HRR이 결핍되면 NHEJ(Non-homologous End Joining)와 같은 대체 복구 경로에 의존합니다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉬운 것으로 알려져 있으며 53BP1을 양성 조절자(¹⁴)로 사용하는 세포에 높은 돌연변이 부담을 유발합니다. 이러한 DNA 손상 단백질은 모두 IF를 사용하여 초점으로 정확하게 식별 할 수 있습니다. 단백질 염색 외에도 IF는 포크 보호 및 단일 가닥 DNA 갭 형성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 안정한 포크를 갖는 능력은 백금 반응과 상관관계가 있으며, 최근에, 갭 검정은 PARP 억제제 6,15,16,17에 대한 반응을 예측할 수 있는 가능성을 보여주었다. 따라서 게놈에 도입된 후 뉴클레오티드 유사체에 대한 염색은 DDR을 연구하는 또 다른 방법입니다.

현재까지, 난소암에서 DDR의 평가는 생체 내 종양의 클론 이질성, 미세 환경 또는 구조를 재현하지 않는 균질한 2D 세포주로 크게 제한되었습니다^18,19. 최근 연구에 따르면 오가노이드는 DDR 메커니즘과 같은 복잡한 생물학적 과정을 연구하는 데 있어 2차원 세포주보다 우수합니다⁶. 본 방법론은 PDO에서 RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA 및 게미닌을 평가합니다. 이러한 방법은 온전한 오가노이드를 평가하고 생체 내 종양 미세 환경과 더 유사한 환경에서 DDR 메커니즘을 연구할 수 있도록 합니다. 컨포칼 현미경 및 자동 병소 계수와 함께 이 방법론은 난소암의 DDR 경로를 이해하고 환자를 위한 치료 계획을 개인화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

종양 조직 및 복수는 세인트루이스 IRB(Washington University)의 워싱턴 대학교에서 승인한 부인과 종양학 생물 저장소의 일부로 환자 동의를 얻은 후 얻었습니다. 진행성 고등급 장액성 난소암(HGSOC)이 있는 환자가 포함되었습니다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 벤치 상에서 실온에서 수행하였다. 모든 시약은 실온에서 제조하고(달리 나타내지 않는 한) 4°C에서 보관하였다.

1. 오가노이드 생성

1. 이전에 발표된 보고서²⁰에 이어 오가노이드를 생성한다.

2. 오가노이드의 도금 및 조사

1. 배양에 오가노이드를 사용하여 피펫 팁을 수동으로 조작하여 배양 접시에서 오가노이드 탭을 제거합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 오가노이드를 수집합니다.
2. 원뿔형 튜브를 1,650 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
3. 1,000 μL의 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 펠릿에 첨가합니다( 재료 표 참조). 용액을 혼합하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션합니다.
4. 용액을 1,650 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
5. 원심분리 및 흡인 후, 펠릿을 1,000 μL의 인산염 완충 식염수에 재현탁시킨다.
6. 용액 10μL를 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 10μL의 트립판 블루와 혼합합니다.
7. 트립판 블루 세포 용액 10μL를 세포 계수 챔버 슬라이드에 넣고 세포 계수기에 삽입합니다( 재료 표 참조).
8. 20μL의 기저막 추출물(BME)당 40,000개의 세포를 8웰 유리 챔버 슬라이드에 플레이트합니다( 재료 표 참조). 이것은 세포가 오가노이드를 형성하고 적절한 크기로 성장할 수 있도록 3-5일 동안 오가노이드를 유지합니다.
9. 이중 가닥 DNA 절단을 유도하려면 도금된 오가노이드에 10 Gray(Gy)의 ɣ-방사선 조사를 실시합니다(조사기에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조).
   참고: 최대 5-10분이 소요될 수 있습니다.
10. 오가노이드를 37°C 및 5%_CO2 의 가습 배양기에서 4시간 동안 배양합니다.

3. 면역형광염색

참고: 부피는 8웰 챔버 슬라이드의 웰당 양(~300μL)을 나타냅니다.

1. 오가노이드의 조사 및 배양 후, 3D 매트릭스를 방해하지 않도록 조심스럽게 피펫으로 배지를 흡인합니다. 300 μL의 PBS로 세척한다.
2. 오가노이드를 300μL의 2% 파라포름알데히드(PFA)에 10분 동안 고정합니다.
   참고 사항 : BME가 해중합되어 흡입될 수 있으므로 너무 오래 방치하지 마십시오.
3. 오가노이드를 300 μL의 염색 완충액으로 세척합니다( 재료 표 참조). 셰이커에 5분 동안 놓습니다.
4. 투과화를 위해 300μL의 투과화 완충액( 재료 표 참조)을 부드럽게 추가하고 20분 동안 배양합니다. 300 μL의 염색 완충액으로 세척한다. 셰이커에 5분 동안 놓습니다.
5. 300 μL의 염색 완충액을 첨가하여 투과화 단계를 차단한다. 셰이커에 30분 동안 둡니다. 피펫을 사용하여 염색 완충액을 흡인합니다.
6. 염색 완충액에 희석한 1차 항체(rabbit anti-RAD51, mouse anti-Geminin, rabbit anti-RPA, mouse anti-ɣH2AX, rabbit anti-Geminin, mouse anti-53BP1, Table of Materials) 300μL를 추가합니다. 4°C에서 16시간 동안 배양합니다.
   참고: 동일한 숙주 동물과 함께 염색하지 마십시오. 항체가 이웃 웰에 섞이지 않도록 뚜껑을 열어 두십시오.
7. 1차 항체 용액을 제거합니다. 쉐이커에서 각각 5분 동안 300μL의 염색 완충액으로 3회 세척을 수행합니다.
8. 염색 완충액에 희석한 2차 항체(염소 항-마우스 Alexa fluor 488 및 염소 항-토끼 Alexa fluor 647; 재료 표 참조) 용액 300μL를 추가하고 암실에서 1시간 동안 배양합니다.
   알림: 모든 후속 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.
9. 2차 항체 용액을 흡인합니다. 희석된 DAPI 300μL를 추가합니다. 셰이커에 5분 동안 놓습니다.
10. 쉐이커에서 각각 5분 동안 300μL의 염색 완충액으로 3회 세척을 수행합니다. 염색 버퍼를 제거하고 챔버 슬라이드에 포함된 제거 키트를 사용하여 챔버를 분리합니다( 재료 표 참조).
    알림: 3D 매트릭스를 방해하기 위해 너무 앞으로 밀지 않도록 하십시오.
11. 팁이 잘린 p200 피펫 팁을 사용하여 각 웰을 오가노이드 탭(예: 각 오가노이드 탭당 20-30μL)으로 덮도록 장착 매체( 재료 표 참조)를 추가합니다.
12. 기포를 피하면서 시편 위에 커버슬립을 놓습니다.
13. 투명한 매니큐어를 바르고 커버 유리의 측면에 페인트를 칠하여 슬라이드를 밀봉합니다. 1시간 동안 굳힌 후 -20°C에 둡니다.
    알림: 이미징 후 슬라이드는 형광 손실을 최소화하면서 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

4. 이미징

1. 컨포칼 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 이멀젼 오일을 사용하여 63x 대물렌즈에서 이미지를 획득합니다.
   참고: 핵 단백질을 이미징하는 경우 63x가 유리하지만 40x도 허용됩니다.
2. DAPI를 사용하여 접안렌즈를 통해 오가노이드를 찾습니다. 사용된 형광단에 따라 현미경 검사에 적합한 필터를 선택합니다. z-stack 이미지를 캡처하기 위한 파라미터를 설정합니다.
   참고: 연구에 사용된 형광단은 DAPI, 488 및 647이었습니다. 405, 488 및 638 레이저를 켜서 염색을 시각화했습니다.
   참고: 권장되는 z-스택은 대물렌즈의 분해능에 따라 다릅니다.
3. 라이브 이미지 조정: 초점, 레이저 강도 등을 설정합니다.
   알림: 레이저 강도가 높을수록 샘플이 광표백될 가능성이 높아집니다. 따라서 최적의 레이저 강도를 선택하십시오.
4. z-stack을 획득합니다.
   참고: 최대 5-10분이 소요될 수 있습니다.
5. z 스택에 수집된 이미지에서 스택당 3개 이상의 이미지를 스크린샷합니다.
   알림: 정량화할 때 핵이 복제되지 않도록 스택 전체에서 스크린샷을 가져와야 합니다.
6. 각 파일을 TIFF로 저장하고 분석을 진행합니다(5단계).

5. 분석

참고: 이전에 게시된 보고서²¹ 이후의 모든 이미지 분석에 JCountPro를 사용합니다. 이 소프트웨어를 구하려면 관련 출판물을 참조하십시오.

1. 파일 선택 탭(프로그램 하단)의 개체 분석 패널(프로그램 상단)에서 TIFF 파일을 선택합니다.
2. 추가를 클릭하여 선택한 파일을 선택한 파일 그룹으로 이동합니다. 디스플레이를 선택합니다.
3. Segmentation 탭에서 핵의 색상으로 blue 를 선택합니다. 자동 분할을 선택하여 핵의 임계값을 최적화합니다.
   참고: 자동 분할이 개체를 정확하게 식별하지 못하는 경우 사용자는 이미지에 대한 미세 조정 및 원시 조정을 조정하거나 사용 설명서를 참조하여 분할을 더욱 최적화할 수 있습니다.
4. 개체 패널에서 큰 개체 자동 분할 및 핵 크기 최적화를 선택합니다.
   참고: 핵의 무조건 크기는 일반적으로 5,000픽셀이고 조건부 크기는 1,500픽셀입니다. 사용 설명서를 참조하여 물체의 크기를 더욱 최적화하십시오.
5. Identify objects(개체 식별)를 선택하여 매개 변수를 테스트합니다.
   알림: 이러한 매개변수가 정확하지 않은 경우 다른 설정과 함께 크기 및 튜닝을 조정할 수 있습니다. 추가 최적화에 대한 지침은 사용 설명서를 참조하십시오.
6. 이미지에 대한 매개변수를 조정한 후 모든 이미지에서 객체 식별을 선택하여 선택한 모든 이미지에서 핵을 식별합니다.
7. 초점 분석 패널(프로그램 상단)을 선택합니다.
8. 파일 선택 탭(프로그램 하단)에서 개체 분석에 사용된 TIFF 파일을 선택하고 화살표 버튼 (>>)을 선택하여 이미지를 이미지 파일 그룹으로 이동합니다.
9. 이동된 이미지 파일 아래의 디렉토리 그룹에서 Manual Edit 폴더를 두 번 클릭하고 ioc 파일을 객체 컬렉션 파일 그룹으로 이동하도록 선택합니다.
   참고: 선택한 모든 TIFF는 ioc 파일과 일치해야 합니다.
10. 선택을 눌러 파일을 선택한 파일 그룹으로 이동합니다. 프로그램 하단에 있는 초점 계수 탭을 선택합니다.
11. 아래 단계에 따라 매개 변수를 최적화합니다.
    1. 탑 햇 설정 인덱스: 12.
    2. 초점 채널: 초점의 색상을 선택합니다(녹색: ɣ-H2AX, 빨간색: RAD51).
    3. H 돔 설정: 돔 높이 %: 30; 임계값 %: 28 및 28.
    4. 모양/크기 설정: 최소 초점 크기, 픽셀: 5. 모양/크기 적용을 선택합니다. 최대 초점 크기(조건부): 32. 최소 진원도, x100 : 96. 최대 초점, 픽셀: 60.
    5. 노이즈 필터: 크기 1.
       참고: 핵이 제미닌 염색에 양성인지 확인하는 경우 두 번째 채널에서 녹색을 선택하고 분석에서 강도를 선택합니다.
12. 매개변수 세트를 테스트하려면 아래 버튼을 순서대로 선택합니다. Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    알림: 이러한 매개변수가 작동하지 않으면 다른 설정과 함께 크기 및 튜닝을 조정할 수 있습니다. 이미지를 더욱 최적화할 수 있는 방법에 대한 자세한 내용은 사용 설명서를 참조하십시오.
13. 매개변수가 선택한 이미지에 최적화되면 자동 카운트 를 선택하여 핵당 각 이미지의 초점을 계산합니다. 두 번째 채널이 필요한 경우 프로그램은 사용할 수 있는 강도를 결정합니다.

제시된 프로토콜은 오가노이드에서 핵 DNA 손상 복구 단백질을 성공적으로 염색, 시각화 및 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 조사 전후에 PDO를 염색하고 평가하는 데 사용되었습니다. PDO는 10Gy의 방사선에 노출되었고 다음 바이오마커에 대해 평가되었습니다: ɣ-H2AX(그림 1), DNA 손상 마커; HRR에 대한 마커인 RAD51(그림 2); 53BP1, NHEJ의 마커; RPA, 복제 스트레스의 지표 (그림 3); 및 G2/S 단계 세포 주기 마커인 geminin(14)이 있습니다. 10 Gy의 용량은 난소 암 6,22에서 DNA 손상을 연구하는 이전에 발표 된 연구를 기반으로 선택되었습니다. JCountPro 소프트웨어를 사용하여 핵을 식별하고 그림매개변수 13을 사용하여 핵 내 병소 수를 정량화했습니다(그림 4). 이 소프트웨어는 핵(그림 4A,B)을 식별한 다음 핵 초점(그림 4C)을 식별하고 게미닌 양성 세포(그림 4D)에서 초점을 필터링합니다.

그림 1: 방사선 조사 전후 PDO의 ɣ-H2AX 초점. 63x 삽입물로 10x에서 조사 전후의 PDO에서 DAPI 및 ɣ-H2AX 초점의 대표 이미지. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 방사선 조사 전후의 PDO에서 RAD51 병소 및 게미닌. DAPI, geminin, RAD51 및 geminin/RAD51 병소 PDO의 공동 염색의 대표 이미지, 63x 삽입으로 10x에서 조사 전후. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 조사 전후 PDO의 RPA 및 53BP1. (a) DAPI, RPA의 대표 이미지; (B) geminin, 53BP1 및 63x 삽입으로 10x에서 geminin/53BP1 병소의 공동 염색. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: JCountPro 소프트웨어 정량화 워크플로우 (A) 객체 분석에서 파란색 채널이 선택되어 파란색 객체, 핵을 식별한 다음 자동 분할(빨간색 화살표)을 선택하여 자동으로 최적화됩니다. (B) 자동 분할에서 물체 크기(핵)는 이미지의 크기와 배율에 맞게 조정됩니다. 매개변수(1)를 테스트하기 위해 객체 식별 버튼이 선택되고 모든 이미지에서 객체 식별(빨간색 화살표) 버튼이 선택되어 각 이미지에 대한 객체(핵)를 식별합니다. (C) 초점 분석 탭에서 이미지가 입력되고 초점 계수 매개 변수가 설정됩니다 : 먼저 초점의 색상이 초점 채널 (녹색)에서 선택됩니다. Top HAT 인덱스는 12로 설정됩니다. H 돔 설정은 돔 높이 백분율로 설정됩니다.tage 30 및 임계값 백분율tage 28; 초점의 모양과 크기는 60에서 최대 초점 크기 픽셀 및 96에서 최소 진원도 x 100의 수동 매개 변수를 사용하여 이미지 크기에 최적화됩니다. 마지막으로 노이즈 필터가 적용됩니다. 설정은 탑 햇, H 돔 및 초점 수(1-3)를 적용하여 테스트합니다. 셀당 ɣ-H2AX 초점을 정량화하려면 시작(빨간색 화살표)을 누릅니다. (D) RAD51 초점의 경우 빨간색으로 변경된 초점 채널을 제외하고 ɣ-H2AX 초점에 대해 그림과 같이 설정이 적용됩니다. 그러나 geminin으로 염색 된 핵을 식별하기 위해 두 번째 채널이 녹색으로 선택되고 분석이 강도로 변경됩니다. 매개변수는 상단 모자, H 돔 및 초점 수(1-3)를 적용한 다음 시작(빨간색 화살표)을 눌러 모든 RAD51 초점을 정량화하고 각 이미지에서 셀당 녹색 강도를 평가하여 테스트합니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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