중개 통증 연구를 위한 오픈 소스 실시간 폐쇄 루프 전기 임계값 추적

Summary

APTrack은 Open Ephys 플랫폼용으로 개발된 소프트웨어 플러그인으로, 실시간 데이터 시각화 및 뉴런 활동 전위의 폐쇄 루프 전기 임계값 추적을 가능하게 합니다. 우리는 이것을 인간 C-섬유 통각수용체와 마우스 C-섬유 및 Aδ-섬유 통각수용체에 대한 미세신경조영술에서 성공적으로 사용했습니다.

Abstract

통각 수용체는 잠재적으로 유해한 유해 자극을 알리는 일차 구심성 뉴런의 한 종류입니다. 통각 수용체 흥분성의 증가는 급성 및 만성 통증 상태에서 발생합니다. 이것은 비정상적인 지속적인 활동을 생성하거나 유해한 자극에 대한 활성화 역치를 감소시킵니다. 이러한 증가된 흥분성의 원인을 식별하는 것은 메커니즘 기반 치료법의 개발 및 검증에 필요합니다. 단일 뉴런 전기 역치 추적은 통각 수용체 흥분성을 정량화할 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 측정을 허용하고 인간과 설치류에서의 사용을 입증하는 응용 프로그램을 개발했습니다. APTrack은 시간적 래스터 플롯을 사용하여 실시간 데이터 시각화 및 활동 전위 식별을 제공합니다. 알고리즘은 임계값 교차를 통해 활동 전위를 감지하고 전기 자극 후 대기 시간을 모니터링합니다. 그런 다음 플러그인은 통각 수용체의 전기 임계값을 추정하기 위해 업다운 방법을 사용하여 전기 자극 진폭을 변조합니다. 이 소프트웨어는 Open Ephys 시스템(V0.54)을 기반으로 구축되었으며 JUCE 프레임워크를 사용하여 C++로 코딩되었습니다. Windows, Linux 및 Mac 운영 체제에서 실행됩니다. 오픈 소스 코드를 사용할 수 있습니다(https://github.com/ Microneurography/APTrack). 전기생리학적 기록은 복재 신경에서 티즈드 파이버 방법을 사용하는 마우스 피부-신경 제제와 표재성 비골 신경에서 미세신경조영술을 사용하는 건강한 인간 지원자 모두의 통각 수용체에서 가져왔습니다. 통각 수용체는 열 및 기계적 자극에 대한 반응과 전도 속도의 활동 의존적 둔화를 모니터링하여 분류되었습니다. 이 소프트웨어는 시간적 래스터 플롯을 통해 활동 전위 식별을 단순화하여 실험을 용이하게 했습니다. 우리는 생체 내 인간 미세 신경조영술 동안, 처음으로, 그리고 C-섬유 및 Aδ-섬유의 생체 외 마우스 전기생리학적 기록 동안 단일 뉴런 활동 전위의 실시간 폐쇄 루프 전기 임계값 추적을 보여줍니다. 우리는 인간의 열에 민감한 C-섬유 통각수용기의 전기적 임계값이 수용장을 가열함으로써 감소한다는 것을 보여줌으로써 원리 증명을 확립합니다. 이 플러그인은 단일 뉴런 활동 전위의 전기적 임계값 추적을 가능하게 하고 통각 수용체 흥분성의 변화를 정량화할 수 있습니다.

Introduction

통각수용기는 말초 신경계의 일차 구심성 뉴런으로, 명백하거나 잠재적으로 조직을 손상시키는 사건에 의해 활성화되며 급성 통증에서 중요한 보호 역할을 합니다¹. 동물 모델, 건강한 인간 지원자 및 환자에서 C-섬유 및 Aδ-섬유 통각 수용체의 전기생리학적 기록은 다양한 범위의 통증 상태에서 감작 및 비정상적인 자발적 활동을 밝혀냈습니다 2,3,4,5,6,7. 환자의 통각 수용체 흥분성의 이러한 변화의 기초가 되는 메커니즘을 이해하면 표적 치료 개입이 가능할 수 있습니다⁸. 그러나,^{특히 환자에서} 통각수용체 흥분성을 직접 평가할 수 있는 도구는 거의 없지만9, 이러한 도구의 유용성에 대한 잠재력은 잘 알려져 있다^10,11.

전신경 전기적 역치 추적은 인간의 축삭 흥분성을 검사하는 데 사용할 수 있다¹². 그러나, 크고 수초화된 말초 뉴런이 감각 화합물 활동 전위의 진폭에 불균형적으로 기여하기 때문에, 전신경 전기적 역치 추적은 C-섬유 기능의 평가를 허용하지 않는다^11,13. 실제로, 이전 연구에서, 당뇨병성 신경병증과 화학요법 유발 다발신경병증이 있는 만성 신경병성 통증 코호트에서 전신경 전기적 역치 추적은 축삭 흥분성에 차이가 없는 것으로 나타났다¹¹.

이전 연구에서, 단일 뉴런 수준에서의 전기적 역치 추적은 생체 외 쥐 피부 신경 제제¹⁴에서 티징된 섬유 기록 동안 C-섬유 통각 수용체의 흥분성을 조사하는 데 사용되었습니다. 저자들은 증가된 칼륨 농도, 산성 조건 및 브래디키닌이 모두 활동 전위 생성에 대한 감소된 전기적 임계값에 의해 반영된 바와 같이 C-섬유 통각 수용체 흥분성을 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 또한, 열에 민감한 통각 수용체의 수용 영역을 가열하면 전기 임계 값이 감소한 반면, 열에 민감하지 않은 통각 수용체는 전기 임계 값이 증가한 것으로 나타났습니다¹⁴. 이것은 단일 뉴런 전기적 임계 값 추적이 가능하고 유용 할 수 있다는 중요한 증거를 제공하지만, 현재 특히 인간 연구에서 이러한 조사를 가능하게하는 소프트웨어 및 / 또는 하드웨어 솔루션은 없습니다.

인간의 경우, 미세신경조영술(microneurography)은 C-섬유의 전기생리학적 특성을 직접 평가할 수 있는 유일한 방법이다¹⁵. 이 접근법은 만성 통증^환자에서 통각 수용체 기능 장애를 입증하는 데 사용되었습니다 2,3,4,5,6,7. 미세 신경조영술은 단일 뉴런 활동 전위를 감지할 수 있습니다. 그러나, 신호 대 잡음비가 낮기 때문에, 연구자들은 C-섬유 활성을 특성화하기 위해 마킹 기법을 사용한다¹⁶. 마킹 기술에서, 역치 상 전기 자극은 피부의 C- 섬유 수용 영역에 적용됩니다. 이 전기 자극은 C 섬유의 전도 속도에 의해 결정되는 일정한 대기 시간에 발생하는 활동 전위를 생성합니다. C-섬유는 활동 의존적 감속을 나타내는데, 이에 따라 전도 속도가 감소하고, 따라서 활동 전위 방전 기간 동안 전도 잠복기가 증가한다¹⁷. 기저 조건에서 C-섬유는 일반적으로 유해한 자극이 없을 때 활동 전위를 생성하지 않으므로 저주파 전기 자극에 대한 전도 대기 시간은 일정합니다. 발화를 유발하는 기계적, 열적 또는 약리학적 자극은 활동 의존적 감속을 유도하여 수반되는 저주파 전기 자극에 의해 유발되는 활동 전위의 잠복기를 증가시킵니다. 이를 통해 낮은 신호 대 잡음비의 맥락에서 적용된 비전기적 자극에 대한 반응을 객관적으로 식별할 수 있습니다. 그러므로, 활성-의존적 감속은 C-섬유⁽¹⁶)를 기능적으로 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 실제로, C-섬유의 상이한 기능적 부류는 자극 주파수를 변화시키는 것을 포함하는 전기 자극 패러다임에서 활동 의존적 감속의 독특한 패턴을 나타낸다^18,19. C-섬유 활동 전위의 이러한 대기 시간의 가변성은 이를 모니터링하도록 설계된 알고리즘에 대한 도전 과제를 제시합니다.

통각 수용체의 지속적인 활동은 저주파 전기 자극 동안 대기 시간의 변동성을 증가시키며, 이는 다시 활동 의존적 속도 저하로 인한 것입니다. 이 증가된 변동성 또는 지터는 흥분성의 정량화 가능한 대리 척도입니다². 활동 전위 잠복기의 가변성의 또 다른 원인으로는 플립플롭(flip-flop)이 있는데, 여기서 단일 뉴런의 대체 말단 가지가 자극되어 유발된 활동 전위가 상호 배타적인 2개(또는 그 이상)의 기준선 대기 시간을 갖도록 합니다⁽²⁰). 마지막으로, 말초 뉴런의 말단 가지의 온도 변화는 열역학적 방식으로 활동 전위 잠복기 변화를 일으키며, 온난화는 전도 속도를 증가시키고 냉각은 전도 속도를 늦춘다⁽¹⁹). 따라서 통각 수용성 C-섬유의 폐쇄 루프 전기 임계값 추적을 수행하려는 모든 소프트웨어는 전기적으로 유발된 활동 전위의 대기 시간 변화를 허용해야 합니다.

C-fiber nociceptor의 종간 전기 임계값 추적이라는 목표를 달성하기 위해 Open Ephys 플랫폼²¹용 오픈 소스 소프트웨어 플러그인인 APTrack을 개발하여 실시간, 폐쇄 루프, 전기 임계값 추적 및 대기 시간 추적을 가능하게 했습니다. 우리는 인간 미세 신경조영술 동안 C-섬유 통각 수용체 전기 역치 추적이 가능하다는 것을 입증하는 개념 증명 데이터를 제공합니다. 또한, 우리는 이 도구가 설치류의 생체 외 티즈드 섬유 전기생리학에 사용될 수 있음을 보여주며, 따라서 인간과 설치류 간의 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기에서는 연구자가 통각 수용체 기능 및 흥분성에 대한 연구를 돕기 위해 이 도구를 구현하고 사용하는 방법을 자세히 설명합니다.

Protocol

인간 미세 신경학 실험은 브리스톨 대학의 생명 과학 학부 연구 윤리위원회 (참조 번호 : 51882)의 승인을 받았습니다. 모든 연구 참가자는 서면 동의서를 제출했습니다. 동물 실험은 브리스톨 대학교 동물 복지 및 윤리 검토 위원회의 승인을 받은 후 1986년 영국 동물(과학적 절차)법에 따라 브리스톨 대학교에서 수행되었으며 프로젝트 라이센스가 적용되었습니다.

1. Open Ephys GUI 및 APTrack 설치

1. 소프트웨어 설명서를 확인하여 지원되는 Open Ephys GUI(그래픽 사용자 인터페이스)의 최신 버전(https://github.com/Microneurography/APTrack#readme)을 찾은 다음 GUI를 다운로드하여 설치합니다.
2. 다음 https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases URL에서 호환되는 GUI 버전을 설치합니다.
3. GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases 에서 최신 버전을 다운로드합니다. Windows 컴퓨터의 경우 .dll 파일을 일반적으로 C:\Program Files\Open Ephys\plugins에 있는 plugins 폴더에 복사합니다. MacOS 컴퓨터의 경우 .bundle 파일을 패키지의 Contents/PlugIns 폴더에 복사합니다.

2. 기록 및 자극 장치의 조립

1. 제조업체에서 제공한 케이블을 사용하여 수집 보드를 컴퓨터에 연결하고 전원을 켭니다.
   참고: 인간 미세 신경조영술의 경우 USB 3.0 아이솔레이터를 사용하여 참가자를 컴퓨터에서 전기적으로 분리했으며 획득 보드는 설치류 연구에 사용되는 주 전압 전원 공급 장치와 달리 휴대용 배터리로 전원을 공급받았습니다. 스테퍼 모터 제어 보드를 제외한 모든 USB 연결은 인간 연구 중에 USB 아이솔레이터를 통과했습니다.
2. I/O 보드를 수집 보드의 아날로그 입력 포트에 연결합니다. Intan RHD 레코딩 헤드스테이지를 SPI(Serial-Peripheral Interface) 케이블을 사용하여 수집 보드에 연결합니다.
   참고: Intan 16채널 바이폴라 헤드스테이지가 여기에 사용되었지만 다른 모노폴라 RHD2000 시리즈 헤드스테이지를 사용할 수 있습니다.
3. PulsePal을 컴퓨터²²에 연결합니다. 마우스 티징 파이버 녹음과 마찬가지로 PulsePal을 사용하여 아날로그 전압 제어 자극기(예: DS4)로 조립하는 경우 2.5.1-2.5.3단계를 따르십시오. 스테퍼 모터를 사용하여 로터리 엔코더 기반 자극기(예: DS7)로 조립하는 경우, 인체 미세신경조영술 기록과 마찬가지로 2.6.1-2.6.8단계를 따르십시오(그림 1).
4. 아래 설명된 대로 GUI에서 신호 체인을 구축합니다.
   1. Rhythm FPGA 플러그인을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 신호 체인으로 드래그하여 신호 체인에 삽입합니다. 이것은 GUI를 수집 보드에 연결합니다. I/O 보드에서 ADC 채널 기록을 시작하려면 ADC 단추를 클릭했는지 확인합니다. ADC 버튼이 켜져 있으면 주황색으로 켜집니다.
      참고: 이전에 기록된 실험 데이터를 재생하려면 시작 시 Rhythm FPGA 대신 파일 리더 플러그인을 사용할 수 있습니다. 이것을 APTrack과 함께 사용하면 이전 실험에서 활동 전위의 시각화 및 대기 시간 추적이 가능합니다.
   2. 신호 체인에 대역 통과 필터를 삽입하십시오. 300-6,000Hz의 기본 설정은 사람과 마우스 녹음 모두에 적합합니다. 또한 그 뒤에 스플리터를 삽입합니다.
   3. APTrack 플러그인을 스플리터의 한쪽에 있는 신호 체인에 삽입하고 LFP 뷰어를 다른 쪽에 삽입합니다. LFP 뷰어는 실험 중에 유용한 기존 오실로스코프와 유사한 전압 트레이스 보기를 제공합니다.
   4. 플러그인 뒤에 레코드 노드를 삽입합니다. 드롭다운 메뉴에서 데이터 저장 형식을 binary에서 Open Ephys로 변경합니다. 이렇게 하면 잘 작동하는 간단한 신호 체인이 완성됩니다(그림 2). 그러나 실험 요구 사항에 따라 추가 구성 요소를 추가할 수 있습니다.
      참고: 레코드 노드가 신호 체인의 플러그인 앞에 배치되면 활동 전위 추적 정보가 저장되지 않습니다.
   5. GUI의 오른쪽 상단에서 재생 버튼을 클릭하여 수집 보드에서 데이터를 전송하고 시각화하기 시작합니다. 녹음을 시작하려면 재생 버튼 옆에 있는 원형 녹음 버튼을 클릭합니다.
      참고: 기록을 클릭하는 것을 잊어버리기 쉽습니다. 이러한 일이 발생하지 않도록 수집을 시작하는 순간부터 데이터를 기록합니다.
5. 아날로그 vol로 조립하는 경우tage-제어 자극기, 아래 설명된 단계를 따르십시오.
   1. 아날로그 전압 입력에 의해 제어되는 자극 진폭이 있는 정전류 자극기의 전원을 켭니다. 이 경우 DS4가 사용되었습니다(그림 1).
   2. PulsePal 출력 채널 1은 아날로그 볼륨용입니다.tage 명령. BNC T-스플리터를 사용하여 이 신호를 분할한 다음 정전류 자극기 입력과 I/O 보드에 연결하여 명령 전압이 기록되도록 합니다.
   3. PulsePal 출력 채널 2는 전기 자극 TTL 이벤트 마커용입니다. 이것을 I/O 보드에 연결하여 플러그인이 사용하고 사후 분석을 위해 자극 TTL 이벤트 마커가 기록되도록 합니다.
6. 아날로그 vol로 조립하는 경우tage-제어 자극기, 아래 설명된 단계를 따르십시오.
   1. 회전식 인코딩 다이얼에 의해 자극 진폭이 제어되는 정전류 자극기의 전원을 켭니다. 이 경우 DS7이 사용되었습니다(그림 1).
   2. 제조업체에서 제공한 케이블과 마그네틱 마운트를 사용하여 스테퍼 모터 제어 보드를 스테퍼 모터에 연결합니다.
   3. 표준 USB A-USB micro-B 케이블을 사용하여 제어 보드를 컴퓨터에 직접 연결합니다. USB 아이솔레이터의 참가자 쪽에 있는 제어 보드는 12V 주 전원 공급 장치에도 연결되어 있으므로 연결하지 마십시오.
   4. 제어 보드를 처음 사용하는 경우 GitHub에서 제어 보드로 스테퍼 모터 스크립트를 업로드합니다. 이 작업은 한 번만 수행하거나 스테퍼 모터 스크립트에 대한 소프트웨어 업데이트가 릴리스된 경우에만 수행하면 됩니다.
   5. 정전류 자극기의 자극 진폭 다이얼을 0mA로 설정합니다. 맞춤형 장착 브래킷을 사용하여 스테퍼 모터와 자극 진폭 다이얼을 인터페이스합니다. 이들은 3D 프린팅이 가능하므로 저렴하고 빠르며 맞춤형 마운팅 솔루션이 가능합니다. GitHub에 문의하여 마운트가 선택한 자극기에 맞게 이미 설계되었는지 확인하십시오.
   6. 맞춤형 배럴 어댑터를 사용하여 스테퍼 모터 배럴을 자극 진폭 조절 다이얼에 연결합니다. 이러한 어댑터는 강도와 내구성을 위해 금속으로 구성되어야 합니다. 그러나 3D 프린팅 부품도 적합하지만 정기적으로 교체해야 할 수도 있습니다. GitHub에 문의하여 배럴 어댑터가 선택한 자극기에 맞게 이미 설계되었는지 확인하십시오.
   7. 맞춤형 마운트와 배럴 어댑터를 사용하여 제어 보드/스테퍼 모터 장치를 자극기 제어 다이얼에 느슨하게 부착합니다.
      알림: 마운트 및 배럴 어댑터는 나중에 소프트웨어가 시작되고 스테퍼 모터가 자동으로 위치 0으로 설정되면 조여집니다.
   8. 프로토콜 단계 2.5.2-2.5.3(출력 채널 1을 자극기에 연결 제외)에 설명된 대로 PulsePal을 연결하는데, 이는 분석 및 플러그인이 작동하기 위해 TTL 이벤트 마커를 생성하는 것이 여전히 필요하기 때문입니다. 또한 출력 채널 2를 DS7 자극기에 연결하여 트리거합니다.
7. 마우스 피부-신경 제제를 아래와 같이 준비한다.
   1. 생후 2-4개월의 C57BL/6J 마우스(이 연구에서는 영국 Charles River Laboratories)에게 음식과 물을 임의로 제공합니다.
   2. 펜토바르비탈나트륨(≥200mg/kg)을 복강내 주사하여 마취 과다 복용으로 도태하고 순환 정지를 확인한 후 Zimmermann et ^al.23에 의해 기술된 방법을 사용하여 마우스 뒷발의 등쪽과 이 부위를 자극하는 복재 신경에서 피부를 해부합니다.
   3. 맞춤형 이중 챔버 아크릴 수조(15mL/분 관류 속도, 30mL 부피)의 절반에서 30-32°C에서 탄소화 합성 간질액(표 1)의 피부-신경 제제를 유지합니다. 미네랄 오일이 채워진 챔버에 작은 구멍을 통해 신경을 끼우고 바셀린으로 밀봉합니다. 오일은 절연된 녹음 환경을 제공합니다.
   4. 초미세 집게를 사용하여 신경의 몸통에서 두 개의 미세한 필라멘트를 떼어내고 양극성 은/염화은 기록 전극의 양쪽에 하나씩 걸어둡니다.
   5. RHD2216 16채널 양극성 헤드스테이지를 사용하여 신경 신호를 디지털화 및 증폭하고 수집 보드를 사용하여 처리합니다. 300-6,000Hz의 대역통과 필터를 사용하여 30kHz에서 신호를 샘플링하고 GUI를 사용하여 시각화합니다.
   6. 무딘 유리 막대를 사용하여 제제의 피부를 치십시오. 진폭이 낮은 질량 활성도를 사용하여 전처리가 살아 있는지 확인합니다.
8. 아래에 설명된 대로 인간 C-섬유 미세신경조영술을 수행합니다.
   1. 앞서 설명한 대로 서면 동의서를 제공한 참가자와 함께 미세신경조영술을 수행합니다²⁴.
   2. 참가자를 침대에 편안하게 기대어 앉히고 베개로 지지한 상태에서 초음파 스캐너를 사용하여 표재성 비골 신경을 식별하고 정강이 중간 수준 주변의 외측 복사뼈 근위 약 5-10cm의 대상 부위를 표시합니다.
   3. 70% 알코올 와이프에 2% 클로르헥시딘을 사용하여 표적 부위 주위의 피부를 소독하고 멸균된 기준 전극을 정강이 중간 수준에서 의도된 기록 부위 근처에 피하 삽입한다.
   4. 멸균 기록 전극을 대상 영역 내의 초음파 유도하에 표재성 비골 신경에 삽입합니다.
   5. RHD2216 16채널 양극성 헤드스테이지를 사용하여 신경 신호를 디지털화 및 증폭하고 수집 보드를 사용하여 처리합니다. 300-6,000Hz의 대역통과 필터를 사용하여 30kHz에서 신호를 샘플링하고 GUI를 사용하여 시각화합니다.
      참고: 수집 장비는 5kV RMS 절연이 있는 USB 3.0 아이솔레이터에 의해 노트북에서 전기적으로 절연되었으며 맞춤형 12V 배터리 전원 공급 장치를 통해 전원이 공급되었습니다.
   6. 기계적으로 유발된 질량 활동을 나타내기 위해 피부를 부드럽게 쓰다듬어 성공적인 신경내 위치를 확인합니다. 또한 참가자는 일반적으로 성공적인 신경내 위치 지정 시 발의 배외측 측면에서 감각 이상을 보고합니다.

3. 말초 뉴런의 소프트웨어 설정 및 식별 및 표현형

1. 아래 설명에 따라 소프트웨어를 설정합니다.
   1. GUI를 엽니다(그림 3). 스테퍼 모터 제어 보드가 PC에 연결되어 있으면 감지되어 위치 0으로 설정됩니다. 자극기의 자극 amp리폭 다이얼과 스테퍼 모터가 모두 0으로 설정되어 있으므로 2.6.5-2.6.7 단계에서 설명한 맞춤형 마운트와 배럴 어댑터를 조입니다.
      알림: 스테퍼 모터와 자극 amp위도 다이얼이 모두 "영점 조정"되지 않은 경우 스테퍼 모터가 제어 다이얼을 범위 밖으로 돌리려고 하여 손상될 수 있습니다.
   2. 옵션 메뉴에서 트리거 채널을 선택합니다. PulsePal 출력 채널 2에서 전기 자극 TTL 마커가 포함된 ADC 채널을 선택합니다.
   3. 옵션 메뉴에서 데이터 채널을 선택하고 전기생리학적 데이터가 포함된 채널을 선택합니다.
   4. 자극 제어판에서 슬라이더를 사용하여 초기, 최소 및 최대 자극 진폭을 정의합니다. TTL 마커가 생성되도록 현재 자극이 0 이상으로 설정되어 있는지 확인합니다.
      알림: 일부 자극기는 1:1이 아닌 입력 대 출력 스케일링 비율을 가지고 있습니다. 적절한 자극 진폭을 선택할 때 이것을 고려하십시오. 예를 들어, 일부 자극 시스템에서는 정전류 자극기에서 더 높은 출력을 얻기 위해 1:10 출력 비율을 선택할 수 있습니다.
   5. 자극 제어판에서 F를 클릭하여 자극 지침이 포함된 파일을 로드합니다. 전기 자극 프로토콜은 원하는 자극 주파수와 지속 시간으로 구성된 CSV(쉼표로 구분된 값) 파일로 저장되므로 사용자는 실험을 위한 복잡한 자극 패러다임을 만들 수 있습니다. 예제 템플릿은 다음에서 사용할 수 있습니다. https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. 자극 제어판에서 > 클릭하여 로드된 자극 패러다임을 시작합니다. 기본적으로 APTrack은 정전류 자극기의 자극 진폭을 제어하기 위해 다양한 진폭의 0.5ms 지속 시간 양의 구형파 펄스를 생성하도록 PulsePal에 요청합니다.
   7. 시간 래스터 플롯은 전기 자극에 대한 반응으로 업데이트되기 시작하며, 각각의 새로운 자극 반응은 오른쪽에 새 열로 표시됩니다.
2. 단일 뉴런 활동 전위를 시각화하고 식별합니다.
   1. 단일 뉴런 활동 전위를 성공적으로 감지하려면 적절한 이미지 임계값을 설정하는 것이 중요합니다. 시간 래스터 플롯 패널에서 low, detection 및 high 이미지 임계값을 조정합니다.
      1. 옵션 메뉴에서 색 구성표를 선택합니다. WHOT(White Hot) 모드(기본값)에서 voltag낮은 이미지 임계값 미만의 es는 검은색으로 인코딩됩니다. 낮은 이미지와 감지 임계값 사이의 전압은 그레이스케일로 인코딩됩니다. 감지 임계값을 초과하는 전압은 녹색으로 인코딩되고 높은 이미지 임계값을 초과하는 전압은 빨간색으로 인코딩됩니다.
   2. 말초 뉴런은 낮은 자극 주파수(<0.25Hz)에서 일정한 대기 시간 반응을 나타내며 이러한 반응은 전도 속도와 자극 부위와 기록 부위 사이의 거리에 의해 결정됩니다. 적절한 이미지 임계값이 설정되면 알고리즘에 의해 감지된 임계값 교차 이벤트가 녹색으로 인코딩됩니다(그림 4).
   3. 기록되는 신경에 의해 신경이 분포된 피부 영역 주위로 자극 전극을 체계적으로 움직여 각 부위에서 최소 3개의 자극 이벤트를 허용합니다. 각 전기 자극 이벤트 후 동일한 시점에서 발생하는 임계값 교차 이벤트(녹색으로 표시)에 대한 시간 래스터 플롯을 모니터링합니다.
      참고: 마우스에서는 5mA의 검색 자극이 사용되었습니다. 인간의 경우 경피적 전기 탐색 자극의 진폭을 7/10을 초과하지 않는 언어 통증 등급으로 적정했습니다.
   4. 동일한 대기 시간 및 동일한 자극 위치에서 연속으로 나타나는 세 개의 임계값 교차 이벤트(녹색 막대)를 확인합니다. 이것은 말초 뉴런 활동 전위의 식별을 나타냅니다.
   5. 표적 뉴런의 수용장에서 전기적으로 가장 민감한 지점을 식별하여 자극 전극 위치를 최적화한 다음 전극을 제자리에 고정합니다. 인간 미세 신경조영술의 이 시점에서 양극성 전기 자극을 위해 피내 전기 침술 바늘(직경 0.2mm)을 사용하는 것으로 전환하고, 마우스에서는 자극 위치가 일정하도록 맞춤형 경피적 자극 프로브를 사용합니다.
3. 말초 뉴런의 분류 및 감각 표현형을 수행합니다.
   1. 시뮬레이션 진폭을 수동으로 조정하거나 원하는 경우 APTrack을 사용하여 목표 활동 전위의 전기적 임계값을 추정합니다(4.1-4.2단계에서 설명).
   2. 감각 표현형 프로토콜 전체에서 0.25Hz의 주파수에서 추정된 전기 임계값의 2배에서 수용 필드를 자극합니다.
   3. 전도 거리를 전도 잠복기로 나누어 뉴런의 전도 속도를 계산합니다. C-섬유는 ≤2m/s의 전도 속도로 식별할 수 있습니다.
   4. von Frey 필라멘트를 사용하여 수용장을 기계적으로 자극하여 활성화를 위한 기계적 임계값을 결정합니다. 기계 감각은 전압 트레이스에서 볼 수 있는 유발된 활동 전위와 뉴런이 C-섬유인 경우 충분한 힘에 따라 뉴런의 대기 시간이 증가하여 식별할 수 있습니다.
   5. 뉴런의 수용 영역을 가열하고 전압 트레이스에서 볼 수 있는 활동 전위와 뉴런이 C 섬유인 경우 충분한 열 인가 시 뉴런의 대기 시간이 증가하는지 다시 관찰합니다. 열에 민감하지 않은 뉴런은 축삭 전파에 대한 열역학적 효과로 인해 잠복기가 감소합니다.
      참고: 인간 미세신경조영술에서는 빠르고 정확한 열 제어를 위해 TSC-II를 사용하십시오. 마우스 준비에서 따뜻하거나 냉각된 합성 간질 유체를 수용장 위에 배치된 알루미늄 격리 챔버에 추가하여 주변 유체로의 빠른 열 방출을 제한하면서 뉴런 말단에 접근할 수 있도록 합니다. 열전대를 사용하여 온도를 기록합니다.
   6. 수용장을 식히고 전압 트레이스에서 볼 수 있는 활동 전위와 뉴런의 대기 시간(C-섬유인 경우)이 충분히 저온 적용되면 뉴런의 대기 시간이 현저히 증가하는 것을 다시 관찰합니다. 모든 뉴런은 축삭 전파에 대한 열역학적 효과로 인해 잠복기가 증가하므로 잠복기 증가만을 기준으로 뉴런을 추위에 민감한 것으로 표시할 때 주의하십시오.

4. 대기 시간 및 전기적 임계값 추적

1. 아래 설명된 대로 대기 시간 추적을 수행합니다.
   1. 시간 래스터 그림에서 단일 뉴런 활동 전위를 식별한 후 시간 래스터 그림의 오른쪽에 있는 회색 선형 슬라이더를 이동하여 검색 상자의 위치를 조정합니다.
   2. 임시 래스터 플롯 아래에서 검색 상자 너비 회전 슬라이더를 적절한 너비로 조정합니다. 일시적인 노이즈 스파이크, 자발적으로 발사되는 활동 전위 또는 기타 근처의 일정한 대기 시간 활동 전위가 관심 있는 활동 전위로 잘못 식별될 가능성을 줄이기 위해 검색 상자 너비를 좁게 만듭니다.
   3. 목표 활동 전위 추적을 시작하려면 다중 단위 추적 테이블 아래에 있는 +를 클릭합니다. 대기 시간 위치, 2-10 자극에 대한 발사 비율(옵션 메뉴에서 조정됨) 및 감지된 최대 진폭을 포함하여 목표 활동 전위에 대한 세부 정보가 포함된 테이블에 새 행이 추가됩니다.
   4. 활동 전위가 다중 장치 추적 테이블에 추가되면 대기 시간 추적 알고리즘(그림 5)이 이후의 모든 전기 자극에 대해 자동으로 실행됩니다.
   5. 시간 래스터 플롯에 여러 개의 이산 활동 전위가 표시되는 경우 위에서 설명한 대로 다중 단위 추적 테이블에 추가합니다. 동시 대기 시간 추적을 위해 테이블에 추가할 수 있는 이론상 최대 활동 전위 수는 최대 32비트 정수 값입니다.
   6. 다중 장치 추적 테이블에서 스파이크 추적 상자를 선택하여 대기 시간 추적 알고리즘에 의해 결정된 특정 활동 전위에 대한 적절한 위치로 검색 상자를 이동합니다. 이렇게 하면 대기 시간 추적을 실시간으로 모니터링하고 추적이 예상대로 활동 전위를 따르고 있는지 확인할 수 있습니다. 다른 스파이크의 대기 시간 추적은 백그라운드에서 정상적으로 계속됩니다.
   7. 각 행의 끝에 있는 삭제 버튼을 사용하여 다중 단위 추적 테이블에서 추적된 활동 전위를 제거합니다.
2. 아래 설명된 대로 전기 임계값 추적을 수행합니다.
   1. 자극 제어 패널의 증감률을 0.1V와 0.5V 사이에서 조정합니다. 이 값을 동일하게 유지하고 실험 패러다임의 일부가 아닌 한 실험 중에 조정하지 마십시오.
   2. 자극 주파수의 변조가 실험 패러다임의 일부가 아닌 한 자극 주파수가 적절한 속도(일반적으로 0.25-0.5Hz)로 설정되어 있는지 확인하십시오. 통각 수용체 발사 속도가 증가하면 통각 수용체의 전기적 임계 값이 변경 될 수 있습니다.
   3. 활동 전위가 성공적으로 추적되면 다중 장치 추적 테이블에서 임계값 추적 상자를 선택하면 전기 임계값 추적 알고리즘이 시작됩니다(그림 6).
      알림: 전기 임계값 추적은 목표 활동 전위에서만 실행됩니다. 실제로, 다중 유닛 추적 테이블에서 다른 활동 전위의 발사 속도는 자극 진폭이 변경됨에 따라 그에 따라 업데이트됩니다.
   4. 자극 진폭을 전기 임계값의 추정치에 맞게 수동으로 조정합니다. 이렇게 하면 전기 임계값을 결정하기 위한 대기 시간이 줄어듭니다. 신뢰할 수 있는 전기적 임계값을 설정하는 데 걸리는 시간은 자극 주파수, 증가 및 감소 속도, 초기 자극에서 뉴런의 전기적 임계값까지의 자극 진폭 차이에 따라 달라집니다.
   5. 이 소프트웨어는 뉴런의 전기적 임계 값을 추정하기 위해 업다운 방법을 사용합니다. 다중 유닛 추적 테이블에서 발사 속도는 2-10 개의 이전 자극 (옵션 메뉴에서 선택)에 대해 결정됩니다. 고려할 자극 이벤트의 수를 선택하십시오. 숫자가 높을수록 임계값 추정치의 신뢰도가 높아지지만 달성하는 데 시간이 더 오래 걸립니다.
   6. 인간 미세 신경조영술 동안 과도한 참가자 불편을 방지하기 위해 전기 자극의 통증을 모니터링하는 것이 중요합니다. 통각 수용체, 특히 조용한/수면하는 C-섬유를 연구하는 동안 약간의 불편함은 피할 수 없습니다. 전기 임계값 추적 중에 자극 진폭이 증가하는 동안 정기적으로 통증 등급을 요청하고 참가자의 요청에 따라 정전류 자극기 근처에 머물면서 통증을 해제합니다.
      알림: 또는 자극 제어판의 [ ] 버튼을 클릭하여 사용자 인터페이스를 통해 전기 자극을 해제할 수 있습니다.
   7. 발사율이 50%이면 대략적인 전기 임계값이 결정되었음을 나타냅니다.
   8. 전기 임계값을 추적하는 동안 온도 또는 약물 조작과 같은 수용 영역에 실험적 조작을 적용합니다. 통각 수용체의 전기 임계값에 대한 이러한 조작의 영향이 추적됩니다.
      알림: 실험 조작 후 새로운 통각 수용체 임계값을 식별하는 데 충분한 시간을 허용하십시오.

Results

실험을 제어하기 위해 작동하는 소프트웨어의 대표적인 예가 그림 7에 나와 있습니다. 업-다운 방법을 사용하여 자극 진폭을 반복적으로 조정하여 단일 통각 수용체의 전기적 임계값을 효과적으로 찾습니다. 처음으로, 우리는 미세 신경조영술 동안 인간의 실시간 단일 뉴런 전기 역치 추적의 타당성을 입증합니다(그림 7A). 또한 마우스 Aδ-파이버에서 전기적 임계값 추적을 보여줍니다(그림 7B). 여기에 사용된 임계값 교차에 의한 활동 전위 식별은 시간 경과에 따른 전기적 임계값을 추적하기에 충분합니다. 사용자는 패러데이 케이지 및 대역 통과 필터를 사용하여 신호 대 잡음비를 개선하는 등 녹음 중에 전기적 잡음을 최소화하기 위한 조치를 취하는 것이 좋습니다.

전기 임계값 추적이 인간의 통각 수용체 흥분성 변화의 척도로 사용될 수 있음을 입증하기 위해 단계적 가열 패러다임 동안 전기 임계값 추적이 수행되었습니다(그림 8). 통각 수용체 단자의 온도를 높이면 통각 수용체 흥분성의 증가를 반영하여 활동 전위를 유도하는 데 필요한 전기 자극 전류가 감소했습니다(그림 8C). 이것은 C-섬유 통각수용기⁽¹⁴)에서 발현된 열에 민감한 이온 채널에 의한 수용체 전위의 생성에 의해 발생했을 가능성이 있습니다. 최고 온도 단계인 44°C에서 열적으로 유발된 활동 전위가 유도되었습니다(그림 8A, 자극 번호 86-96). 이로 인해 통각 수용체가 고주파 방전 후 내화 상태가 될 수 있으므로 전기 임계값이 증가합니다. 예상대로, 추적 된 활동 전위의 대기 시간은 온도가 증가함에 따라 감소했습니다. 이것은 C-섬유의 전도 속도를 증가시키는 전도 기계에 대한 열역학적 효과로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. 이 C-파이버는 또한 플립플롭(그림 8B, 자극 번호 47-54)을 나타낼 수 있으며, 이로 인해 활동 전위가 알고리즘 검색 창을 벗어나면 다음과 같은 전기 자극의 진폭이 잘못 증가할 수 있습니다.

그림 1: 설치류와 인간에서 APTrack을 사용한 통각 수용체 전기 임계값 추적에 필요한 장비 설정 및 케이블 연결의 개략도. 자극 진폭 제어의 두 가지 다른 방법, 즉 인간 설정에서 수동으로 조정된 자극기를 위한 스테퍼 모터와 설치류 설정에서 입력 전압 제어 자극기를 위한 PulsePal에 주목하십시오. (1) Open Ephys 플랫폼용 플러그인을 실행하는 PC(Windows, Mac 또는 Linux). (2) DS7의 자극 진폭 다이얼을 작동시키는 스테퍼 모터. (3) 인간에게 사용하도록 승인된 정전류 자극기; 여기서는 DS7을 사용했습니다. (4) USB 3.0 광절연기, 인간 참가자를 PC에서 격리합니다(선택 사항, 인간 연구에만 필요). (5) PulsePal V2 펄스 발생기는 TTL 타임 스탬프(출력 채널 2)와 요청된 자극 진폭에 해당하는 전압 스텝(출력 채널 1)을 생성합니다. (6) 동물에 사용하기 위한 정전류 자극기; 여기서는 DS4를 사용했습니다. (7) 시스템용 DC 전원 공급 장치(설치류 설정에 사용되는 주 DC 전원 공급 장치 및 사람 설정에 사용되는 배터리 DC 전원 공급 장치). (8) 인수 위원회. (9) 열전대 출력 및 TTL 마커와 같이 기록할 신호를 전달하는 BNC 동축 케이블을 연결하는 I/O 보드. (10) 통각수용기 전기생리학적 기록을 받는 마우스 피부-신경 제제. (11) 표재성 비골 신경의 C-섬유에서 미세신경조영술 기록을 받는 인간 참가자. (12) 녹음 수집 및 디지털화를 위한 Intan RHD2216 헤드스테이지. (13) 녹음 전극이 연결되어 있고 신호가 RHD2216 헤드스테이지로 전달될 수 있도록 하는 Intan 전극 어댑터 보드. (14) BNC 동축 연결을 통해 온도를 출력할 수 있는 열 자극 시스템. (15) 기계적 자극 이벤트 및 약물 적용을 표시하는 데 사용되는 3.3V 배터리 구동 버튼/풋 페달. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 템플릿 신호 체인. 빨간색 화살표는 I/O 보드에서 ADC 입력을 활성화하기 위한 버튼을 가리킵니다. 노란색 화살표는 Open Ephys 파일 형식을 선택하기 위한 드롭다운 메뉴를 나타냅니다. 녹색 화살표는 재생 및 녹음 버튼을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 그래픽 사용자 인터페이스 GUI는 네 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. (1) 데이터 시각화를 위한 Temporal Raster Plot 패널(녹색) 및 플롯 제어와 관련된 설정. 점진적인 활동 의존적 속도 저하를 보여주는 일정한 대기 시간 응답은 녹색 화살표로 표시됩니다. (2) 자극 진폭 파라미터를 설정하고 자극 패러다임 스크립트를 로드하기 위한 자극 제어판(노란색). (3) 대기 시간 및 전기적 임계값 추적을 추적하고 활성화하기 위한 활동 전위를 추가하기 위한 다중 장치 추적 테이블(파란색). (4) 데이터 및 TTL 트리거에 대한 색상 스타일과 입력 채널을 선택할 수 있는 옵션 메뉴입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: APTrack을 사용하여 시간적 래스터 플롯에서 실시간 데이터 시각화를 통해 일정한 대기 시간 활동 전위 식별을 용이하게 합니다. 이것은 높은 신호 대 잡음비의 예입니다. 측두엽 래스터 플롯에 제시된 데이터는 미세신경조영술 동안 표재성 비골 신경에서 기록된 인간 C-섬유에서 가져온 것입니다. Voltage Trace는 Open Ephys의 오실로스코프와 유사한 LFP 뷰어 플러그인입니다. APTrack 사용자 인터페이스는 플러그인의 그래픽 사용자 인터페이스입니다. 추적된 활동 전위는 녹색 화살표로 표시되며, 시간 래스터 플롯의 경계에 있는 원형 슬라이더는 알고리즘이 임계값 교차 이벤트를 검색할 검색 상자 위치를 제어하기 위한 것입니다. 전기 자극 아티팩트는 전압 트레이스에 파란색으로 표시됩니다. 아날로그 전압 명령의 자극 진폭은 빨간색으로 표시됩니다. 이것은 자극기에 설정된 스케일링 팩터에 따라 자극 전류 진폭과 동일하지 않을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 지연 시간 추적 알고리즘의 그래픽 표현. 간단히 말해서, 임계 값 교차에 의해 활동 전위가 감지되면 검색 상자는 피크 전압 시간에 중심에 위치하도록 위치를 조정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 전기 임계값 추적 알고리즘의 그래픽 표현. 간단히 말해서, 임계 값 교차에 의해 활동 전위가 감지되면 자극 진폭은 감소율만큼 감소합니다. 활동 전위가 감지되지 않으면 자극 진폭이 증가율만큼 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 0.25Hz 자극 주파수에서 단일 뉴런 활동 전위의 자동화된 전기적 임계값 추적 . (A) 미세 신경조영술 실험 중 표재성 비골 신경의 인간 C-섬유의 순차적 흔적. (B) 피부-신경 준비 중 복재 신경의 마우스 Aδ-섬유의 순차적 흔적은 섬유 전기생리학을 괴롭혔습니다. 활동 전위가 확인되었을 때 흔적은 빨간색으로 표시되어 자극 진폭이 감소했습니다. 소프트웨어 알고리즘은 50%의 발사 가능성에 필요한 자극 진폭을 효과적으로 찾습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 인간 C-섬유 통각 수용체의 열 자극 동안 0.25Hz 자극 주파수에서 전기적 임계값 추적. y축은 패러다임의 시작부터 자극 수를 인코딩합니다. (A) 전기 자극 후 4,000ms 동안의 전압 추적, 임계값 초과 이벤트는 빨간색으로 표시됨. (B) A 의 전압 추적은 추적된 활동 전위 주위를 확대합니다. 추적된 활동 전위가 감지되었을 때 흔적은 빨간색으로 표시되었습니다. 파란색 세로선은 추적된 단위의 기준 지연 시간입니다. (C) APTrack이 명령하는 자극 전류. 파란색 세로선은 기준 전기 임계값입니다. (D) 수용장 TCS-II 열 자극 프로브 온도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

화합물	농도
염화나트륨(NaCl)	107.8 밀리엠
나코3	26.2 밀리엠
케이씨엘	3.5 밀리엠
NaH2포4	1.67 밀리엠
CaCl2	1.53 밀리엠
마그네슘4	0.69 밀리엠
글루콘산나트륨	9.64 밀리엠
자당	7.6 밀리엠
포도당	5.55 밀리엠

표 1: 마우스 피부신경 제제를 위한 합성 간질액의 함량²³.

Discussion

APTrack은 Open Ephys 플랫폼과 함께 사용하기 위한 소프트웨어 플러그인입니다. 우리는 이 플랫폼을 오픈 소스이고 유연하며 구현 비용이 저렴하기 때문에 선택했습니다. 정전류 자극기의 비용을 포함하지 않고 플러그인 사용을 시작하는 데 필요한 모든 장비는 작성 당시 약 $5,000 USD에 구입할 수 있습니다. 이를 통해 연구자들이 말초 신경 전기생리학 연구에서 APTrack을 보다 쉽게 구현할 수 있기를 바랍니다. 또한 연구원은 실험 요구 사항에 맞게 소프트웨어를 자유롭게 수정할 수 있습니다. 중요한 것은 이 도구를 통해 처음으로 인간에서 단일 C-섬유 통각 수용체의 전기적 임계값 추적이 가능해졌다는 것입니다.

신호 대 잡음비가 높을수록 알고리즘이 활동 전위를 더 잘 식별할 수 있습니다. 미세 신경조영술 중 신호 대 잡음비는 대부분의 기록에서 충분했지만 사용자는 시간이 지남에 따라 신호 저하 위험에 주의해야 합니다. 이는 추적된 활동 전위의 진폭이 검출 임계값 아래로 떨어지면 자극 진폭이 실수로 증가하기 때문에 더 긴 실험 프로토콜에 특히 중요합니다. 실험자가 플러그인을 모니터링한 다음 필요한 경우 설정을 조정하여 이 문제를 완화할 수 있습니다. 신호 대 잡음비는 대역 통과 필터링을 통해 개선되지만 더 큰 과도 현상은 검색 상자 시간 창 동안 도착하는 경우 여전히 활동 전위로 잘못 식별 될 수 있습니다. 과도 노이즈를 활동 전위로 잘못 식별할 위험은 플러그인이 활동 전위를 검색하는 시간 창을 좁히고 임계값 설정을 최적화하여 줄일 수 있습니다. 그러나 플러그인의 성능을 저해하는 상황이 여전히 발생할 수 있습니다. 자발적인 활동은 더 큰 진폭의 활동 전위가 알고리즘의 검색 상자 창에 속하는 경우 목표 활동 전위로 잘못 식별되기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한 관심 뉴런의 자발적인 활동은 전기 자극이 불응 기간 동안 떨어져 활동 전위를 생성하지 못한다는 것을 의미할 수 있습니다. 소프트웨어를 사용하는 어려움은 일차 구심성 뉴런이 플립플롭(flip-flop)을 나타낼 때에도 발생할 수 있으며, 이에 따라 단일 뉴런의 대체 말단 가지가 자극되어 유발된 활동 전위가 상호 배타적인^2개(또는 그 이상)의 기준선 대기 시간을 갖도록 합니다. 높은 신호 대 잡음비로 플립 플롭을 나타내는 뉴런에서 기록하는 동안 뉴런이 나타내는 모든 잠재적 전도 속도를 캡슐화하기 위해 검색 상자 너비를 늘려 대기 시간 및 전기적 임계 값 추적을 성공적으로 수행했습니다. 그러나 전기적 임계값은 여기되는 뉴런의 말단 가지에 따라 달라질 수 있으며, 이는 부분적으로 전기 자극 부위에서 대체 통각 수용체 말단까지의 거리 차이로 인한 것일 수 있습니다. 예를 들어, 템플릿 매칭을 포함하는 행동 전위 식별 프로세스에 대한 추가 작업이 가능하며 이 소프트웨어에 통합될 수 있습니다. 대역 정지 또는 적응형 노이즈 필터링을 위한 GUI 플러그인은 개발될 경우 신호 체인에서 APTrack의 업스트림으로 사용될 수도 있습니다.

우리는 결정된 전기 임계값을 사용자가 정의한 전기 자극 수(일반적으로 2-10)에 대해 시간의 50%를 통해 활동 전위를 유도하는 데 필요한 전류로 간주합니다. 전기 자극의 형태는 0.5ms이고 양의 구형파 펄스입니다. 이것은 신경 흥분성의 일반적으로 사용되는 척도인 레오베이스를 결정하는 것과 동일하지 않습니다. 플러그인은 레오베이스를 결정하도록 조정할 수 있습니다. 그러나 가열 중에 발생하는 것으로 가정된 것과 같은 흥분성의 동적 변화는 전기적 임계값 추정치보다 가변 염기 변화로 정량화하기가 더 어려웠을 것이기 때문에 더 간단한 측정을 추구했습니다.

이 소프트웨어는 인간과 설치류 실험 모두에 사용할 수 있습니다. 이는 전기 자극 시스템에 대한 유연한 지원으로 가능합니다. 이 소프트웨어는 아날로그 명령 전압을 수용하거나 스테퍼 모터와 수동으로 인터페이스할 수 있는 모든 자극기와 함께 작동합니다. 미세 신경조영술의 경우 인간 연구에 사용하도록 설계되고 다이얼로 자극을 제어하는 CE 마크 정전류 자극기와 함께 사용했습니다. 아날로그 볼륨을 받아들이는 자극기tage 명령은 자극 사이의 회로를 분리하지 않기 때문에 잡음이 있을 수 있으며, 이는 아날로그 입력의 50/60Hz 윙윙거리는 소리 또는 노이즈가 녹음으로 전송됨을 의미합니다. 회로를 연결하기 위해 추가 TLL 트리거 신호가 필요한 자극기는 아날로그 전압 입력과 유사한 전류에서 자극을 생성할 수 있으므로 플러그인과 함께 사용하기에 이상적입니다. 이렇게 하면 자극 사이에 소음이 녹음으로 전달되는 것을 방지할 수 있습니다.

이 소프트웨어는 간단한 업-다운 방법을 사용하여 전기 임계값을 추정합니다. 이것은 수십 년 동안 정신 물리학 시험에 사용되어 왔습니다²⁵. 업다운 방법에 따라 자극 진폭을 조절하기 위한 전기적 임계값 추적 알고리즘은 다음 자극의 진폭을 계산할 때 이전 자극의 진폭과 반응만 고려합니다. 즉, 자극 진폭이 실제 전기 임계값 주위에서 진동하므로 임계값이 안정적이라고 가정할 때 50%의 발사 속도를 생성합니다. 증가 또는 감소의 최소 크기는 0.01V입니다. 이는 자극기가 1V:1mA 입력-출력 비율과 이 작은 스텝 변화를 달성하기에 충분한 분해능을 갖는다고 가정할 때 0.01mA에 해당합니다. 플러그인은 사용자가 정의한 이전 자극 수(50-2)에 대해 10% 발사 속도에 도달할 때마다 목표 활동 전위의 전기적 임계값에 대한 실시간 추정치를 업데이트합니다. 사후, 전기적 임계값을 추정하기 위해 마지막 2-10 자극에 대한 자극 진폭의 롤링 평균을 사용하는 것이 좋으며, 이 추정치는 발사 속도가 50%로 비교적 안정적인 경우에만 정확하다는 점에 유의해야 합니다. 전기 임계값의 실시간 및 사후 추정치에는 분해능, 신뢰성 및 고려해야 할 시간의 균형이 있습니다. 더 작은 증가 및 감소 단계를 사용하면 전기 임계값 추정치의 정확도가 증가하지만 섭동 후 초기 및 이후에 새 전기 임계값을 찾는 데 걸리는 시간이 늘어납니다. 더 많은 수의 이전 자극에 대해 전기 임계값을 계산하면 더 나은 신뢰성을 제공하지만 정확한 추정치에 도달하는 데 필요한 시간이 늘어납니다.

APTrack은 말초 신경 기록에 사용하도록 설계되었으며, 특히 활동 전위 잠복기가 기본 신경 활동에 따라 달라질 수 있는 기간 동안 실험 및 병리학적 섭동 동안 C-섬유의 전기적 임계값을 추적하기 위해 설계되었습니다. 이 방법을 사용하면 축삭 흥분성뿐만 아니라 건강한 지원자와 환자의 통각 수용체 생성 가능성을 검사할 수 있습니다. 우리는 전기 생리학의 다른 분야가 자극 고정 활동의 전기적 임계값 추적이 필요한 모든 실험에 사용하기 위해 이 도구를 채택하고 조정할 수 있을 것으로 예상합니다. 예를 들어, 이것은 APTrack에서 구동되는 광 펄스를 사용한 광유전학적 자극에 쉽게 적응할 수 있습니다. 플러그인은 오픈 소스이며 GPLv3 라이선스에 따라 연구원이 사용할 수 있습니다. 적응 가능하고 저렴한 오픈 소스 데이터 수집 시스템인 Open Ephys 플랫폼을 기반으로 합니다. 플러그인은 다운스트림 플러그인에 대한 추가 후크를 제공하여 작업 잠재적 정보를 추출하고 추가 사용자 인터페이스 또는 적응형 패러다임을 제공합니다. 플러그인은 실시간으로 활동 전위의 시각화 및 대기 시간 추적을 위한 간단한 사용자 인터페이스를 제공합니다. 또한 이전 데이터를 재생하고 시간 래스터 플롯을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 또한 이전 데이터를 재생하는 동안 대기 시간 추적을 수행할 수도 있습니다. 실시간 레이턴시 트래킹을 위해 이용 가능한 다른 소프트웨어 패키지들이 있지만, 이들은 오픈 소스가 아니며, 전기적 임계 값 트래킹^(26,27)을 수행할 수 없다. APTrack은 데이터 시각화를 위해 시간적 래스터 플롯을 사용하기 때문에 전압 트레이스로부터 일정한 대기 시간 활동 전위를 식별하는 전통적인 방법에 비해 이점이 있습니다. 또한, 신호 대 잡음비가 낮은 실험에서 이를 사용한 경험에 따르면 시간적 래스터 플롯 시각화 방법을 사용하면 놓쳤을 수 있는 일정한 대기 시간 활동 전위를 식별할 수 있습니다.

전신경 역치 추적(whole-nerve threshold tracking)은 축삭 흥분성을 평가하기 위해 널리 사용되는 방법이다¹³. 설치류 C-섬유에서 단일 뉴런 전기적 역치 추적은 통각수용체 흥분성을 정량화하기 위해 이전에 사용되어 왔으며¹⁴, 인간에서의 유용성은 인정되고 있다^10,11; 그러나 지금까지는 불가능했습니다. 우리는 설치류 및 인간 말초 신경 전기생리학적 연구 모두에서 단일 통각 수용체 흥분성을 직접 측정할 수 있는 새로운 오픈 소스 도구를 제공합니다. APTrack은 최초로 인간의 단일 뉴런 활동 전위에 대한 실시간 오픈 소스 전기적 임계값 추적을 가능하게 합니다. 우리는 그것이 설치류와 인간 사이의 통각 수용체에 대한 번역 연구를 촉진 할 것으로 기대합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12V DC 전원 공급 장치	NA		NA uStepper S-lite에 전원을 공급합니다. 다이얼 제어 자극기에 필요합니다.
36 핀 전극 어댑터 보드	Intan Technology	C3410	APTrack 종속성. 전극 입력을 헤드스테이지에 연결하기 위해. 2021년 3월 기준 미화 255달러.
APTrack 플러그인	NA	NA	https://github.com/Microneurography/APTrack
양극성 Ag/AgCl 기록 전극			피부 신경 준비를 위한 맞춤형 NA 기록 전극. 또는 이와 동등합니다.
양극성 동심 자극 전극	세계 정밀 기기	SNE-100	마우스 피부 신경 준비의 전기 자극용. 또는 이와 동등합니다.
Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode	Custom	NA	미세신경 촬영 중 단일 뉴런 활동 전위를 찾는 동안 경피적 전기 자극용.
BNC T 스플리터(1+)	NA	NA	APTrack 종속성. 모든 표준 BNC T 스플리터.
BNC-BNC 케이블(3+)	NA	NA	APTrack 종속성. 모든 표준 BNC 케이블.
C6H11NaO7	Merck	S2054	피부 신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
CaCl2	Merck	C5670	피부 신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
Digitimer DS4 정전류 자극기	Digitimer	DS4	동물 연구용 정전류 자극기. &파운드; 2022년 9월 기준 1,695GBP.
Digitimer DS7 정전류 자극기	Digitimer	DS7A	인간 연구를 위한 정전류 자극기. &파운드; 2022년 9월 기준 3,400GBP.
Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes	Harmony Medical	NA	인간 미세신경 촬영 중 발의 등쪽 측면에 대한 고정 위치 피내 전기 자극용.
Glucose	Fisher Scientific	G/0450/60	피부-신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
HDMI 케이블	NA		NA, APTrack 종속성. 모든 표준 패시브 HMDI 케이블. OE I/O 보드를 OE 수집 보드에 연결합니다.
KCl	Merck	P9541	피부-신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
MgSO4	Acros Organics	213115000	피부 신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
미네랄 오일	Merck	330779	피부-신경 준비에서 신경 기록을 위한 전기 절연. 또는 이와 동등합니다.
NaCl	Merck	S9888	피부 신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
NaHCO3	Merck	S6014	피부 신경 제제 합성 간질 유체 성분. 또는 이와 동등합니다.
NaHCO3	Merck	S0751	피부 신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
Open Ephys 수집 보드	Open Ephys	NA	APTrack 종속성. 컴퓨터 및 주 소켓 전원 공급 장치에 연결하기 위한 USB 케이블이 포함되어 있습니다. &유로; 2022년 9월 기준 2,955 EUR.
Open Ephys 그래픽 사용자 인터페이스	Open Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O 보드	Open Ephys	NA	APTrack 종속성. BNC 케이블을 통한 ADC 전압 입력용. &유로; 12.5 EUR(커넥터 제외), &유로; 2022년 9월 기준 커넥터가 있는 85유로.
PulsePal V2	Sanworks	1102	APTrack 종속성. 오픈 소스 DAC 및 기차 생성기. 2022년 9월 기준 미화 725달러(USD)가 사전 조립되었습니다. 자체 조립의 경우 약 $275 USD.
RHD 6ft SPI 케이블	Intan Technology	C3206	APTrack 종속성. 헤드스테이지를 OE 획득 보드에 연결하기 위한 것입니다. 2021년 3월 기준 $295 USD
RHD2216 16ch Bipolar Headstage	Intan Technology	C3313	APTrack 종속성. 데이터 수집 및 디지털화를 위해. 2021년 3월 기준 미화 725달러. 또는 이와 동등한 RHD2000 시리즈 헤드 스테이지.
Sucrose	Fisher Scientific	S/8560/60	피부-신경 제제 합성 간질액 성분. 또는 이와 동등합니다.
TCS-II 열 자극기	QST. Lab	NA	인간 미세신경 조영술 중 통각 수용 영역의 열 자극을 위해.
텅스텐 미세 전극 쌍 (활성 + 참조)	FHC	30085	미세 신경 촬영 기록용.35mm.
초음파 스캐너 iQ+	Butterfly Network	NA	미세신경조영술 중 초음파 유도 전극 삽입용.
USB 3.0 5kV RMS 절연	Inota 기술	7055-D	인간 미세 신경 조영술 참가자를 컴퓨터에서 격리하기 위해. &유로; 2022년 9월 기준 459 EUR.
USB-A-마이크로 USB-B 케이블 (2)	NA	NA	APTrack 종속성. 스테퍼 자극기 인터페이스를 사용하는 경우 컴퓨터를 PulsePal 및 uStepper S-lite에 연결합니다.
uStepper S-lite + NEMA17 모터	uStepper	NA	제어 다이얼을 통해 자극기와 인터페이스합니다. &유로; 2022년 9월 기준 50유로.
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275	통각 수용기의 감각 표현형 분석 중 수용장의 기계적 자극용.