TrackMate Analysis of Calcium Imaging(TACI)은 z축의 움직임을 검사하고 각 z-스택의 최대값을 식별하여 해당 시점에서 세포의 강도를 나타내는 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 오픈 소스 ImageJ 플러그인입니다. 측면(x/y) 방향으로 겹치지만 다른 z-평면에서 겹치는 뉴런을 분리할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경과학 연구는 복잡한 이미징 및 계산 도구를 사용하여 데이터 세트에서 포괄적인 정보를 추출하도록 발전했습니다. 칼슘 이미징은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 정교한 소프트웨어가 필요한 널리 사용되는 기술이지만 많은 실험실에서 최신 표준을 충족하도록 프로토콜을 업데이트할 때 계산 방법을 채택하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 프로그래밍 지식과 소프트웨어에 대한 페이월의 부족으로 인해 어려움이 발생합니다. 또한 관심 세포는 칼슘 이미징 중에 모든 방향으로 움직임을 나타냅니다. 측면(x/y) 방향의 모션을 수정하기 위해 많은 접근 방식이 개발되었습니다.
이 백서에서는 새로운 ImageJ 플러그인인 TACI(TrackMate Analysis of Calcium Imaging)를 사용하여 3D 칼슘 이미징에서 z축의 모션을 검사하는 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 소프트웨어는 뉴런이 나타나는 모든 z-위치에서 최대 형광 값을 식별하고 이를 사용하여 해당 t-위치에서 뉴런의 강도를 나타냅니다. 따라서 이 도구는 측면(x/y) 방향으로 겹치지만 별개의 z-평면에 나타나는 뉴런을 분리할 수 있습니다. ImageJ 플러그인인 TACI는 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 사용자 친화적인 오픈 소스 계산 도구입니다. 우리는 온도 변동 동안 모든 방향으로의 움직임을 표시하는 파리 유충 온도에 민감한 뉴런과 파리 뇌에서 얻은 3D 칼슘 이미징 데이터 세트를 사용하여 이 워크플로를 검증했습니다.
서론
세포 내 칼슘 수치는 신경 흥분성의 정확한 지표입니다. 칼슘 이미징은 세포 내 칼슘의 변화를 측정하여 신경 활동을 이해합니다1. 신경과학 연구에서는 유전적 접근을 통해 특정 뉴런 세트에서 비침습적으로 발현될 수 있는 GCaMP 2,3과 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 포함하여 세포 내 칼슘 농도를 측정하는 기술의 개발로 인해 이 방법을 점점 더 많이 사용하고 있습니다. 레이저와 현미경 부품의 비용 절감은 칼슘 이미징의 사용도 증가시켰다4. 중요한 것은 칼슘 이미징을 통해 자유롭게 움직이는 동물에서 단일 뉴런과 큰 뉴런 집단을 동시에 기록하고 연구할 수 있다는것입니다 5.
그럼에도 불구하고, 칼슘 이미징 데이터의 분석은 (1) 시간 경과에 따른 개별 세포의 형광 변화를 추적하는 것을 포함하고, (2) 형광 신호가 간헐적으로 사라지거나 뉴런 반응과 함께 다시 나타나고, (3) 뉴런이 모든 방향, 특히 초점면 안팎으로 이동하거나 여러 평면에 나타날 수 있기 때문에 어렵습니다
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프로토콜
1. 칼슘 이미징
- 파리 애벌레 준비
참고: 파리와 유충은 25시간 12시간 명암 주기에서 12°C로 유지됩니다.- CO2로 파리를 마취하십시오. 20-45마리의 수컷과 20-45마리의 암컷을 각각의 플라이 바이알에 분류하고,CO2 노출로부터 회복하기 위해 적어도 24시간 내지 48시간을 준다.
알림: CO2 에 대한 비행 노출은 가능한 한 최단 시간 동안 지속되어야 합니다. - 유충의 나이를 맞추려면 효모 과립이 들어있는 새 바이알에 파리를 두드리고 4-8 시간 동안 알을 낳습니다. 파리를 새 바이알로 뒤집어 제거합니다.
- 20% w/v 자당 용액 10mL를 사용하여 72시간에 유충을 수집합니다.
- CO2로 파리를 마취하십시오. 20-45마리의 수컷과 20-45마리의 암컷을 각각의 플라이 바이알에 분류하고,CO2 노출로부터 회복하기 위해 적어도 24시간 내지 48시간을 준다.
- 현미경 및 온도 제어 설정
- 컨포칼 현미경( 재료 표 참조)과 z축 피에조 스테이지에서 이미징을 수행합니다.tage 다음 설정을 사용하여 스테이지 인서트가 있습니다. 레이저, 아르곤; 스캔 모드, 프레임; 프레임 크기, 512 x 512; 속도, 최대; 채널/비트 심도, 1/8비트; 줌, 1.5; z-스택, 슬라이스 = 15, 유지 = 슬라이스;....
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결과
3D 칼슘 이미징 분석의 워크플로우
이 연구에서는 새로운 ImageJ 플러그인인 TACI를 개발하고, z-드리프트를 추적하고 여러 z-위치에 나타나는 개별 세포의 반응을 정확히 찾아내는 3D 칼슘 이미징을 분석하는 워크플로우를 설명했습니다(그림 1). 이 도구에는 RENAME, ORGANIZE, EXTRACT 및 MERGE의 네 가지 기능이 있습니다. 첫째, 이미지 이름이 ORGANIZE 함수와 호환되지 않는 경우 RENAME 함수는 이미지 이름을 필요한 구조로 변환할 수 있습니다. 그런 다음 ORGANIZE 함수는 그레이스케일(필요한 경우)을 만들고 3D 칼슘 이미징 TIFF 데이터를 z 위치별로 구성합니다. 동일한 z 위치의 이.......
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토론
이 연구에서는 새로운 ImageJ 플러그인인 TACI를 개발하고 3D 칼슘 이미징을 분석하는 워크플로를 설명했습니다. 현재 사용 가능한 많은 도구는 x/y 모션을 수정하는 데 중점을 두고 있지만 z축의 모션도 명시적으로 진단하거나 수정해야 합니다6. 살아있는 유기체에서 이미지를 획득하는 동안 유기체가 고정되어 있어도 z축의 움직임은 피할 수 없으며 온도 변화와 같은 일부 자극은 종종 상당한 z-드리프트를 유발합니다. z-스택의 높이를 높이면 전체 이미징 프로세스 동안 관심 있는 셀을 기록할 수 있습니다. 그러나 특히 개별 셀이 여러 z 위치에 나타날 때 Z축의 움직임을 분석하는 것은 간단하지 않습니다. 그러한 움직임이 무시된다면 연구자들은 이러한 세포의 정확한 칼슘 반응을 얻지 못할 것입니다. TACI는 모든 z-위치에서 형광 신호를 추출하여 z-드리프트를 보정합니다. TACI의 중요한 단계는 각 시점에서 최대값을 정렬하고 이를 사용하여 세포의 강도를 나타내는 것입니다. 따라서 이미징 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Fralin Imaging Center의 Zeiss LSM 880을 사용하여 칼슘 이미징 데이터를 수집했습니다. IMARIS 소프트웨어에 도움을 주신 Michelle L Olsen 박사님과 Yuhang Pan 박사님께 감사드립니다. 원고에 대한 건설적인 의견을 주신 Lenwood S. Heath 박사님과 GitHub README 파일에 대한 의견을 주신 Steven Giavasis에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH R21MH122987(https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) 및 NIH R01GM140130(https://www.nigms.nih.gov/)에 의해 L.N.에 의해 지원되었습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| 칼슘 클로라이드 디하이드레이트 | Fisher Scientific | 10035-04-8 | 플라이 식품 성분 |
| 이산화탄소 | Airgas | UN1013 | 크기 200 고압 강철 실린더 |
| CO2 버블러 키트 | Genesee | 59-180 | |
| 컨포칼 현미경 LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | 5개의 레이저, 2개의 표준 PMT 검출기, 32채널 GaAsP 검출기, Airyscan 검출기 및 Definite가 장착된 반전 Axio Observer Z1 초점.2. |
| DAQami 소프트웨어 | 측정 컴퓨팅 | ||
| 포도당 Genesee | 62-113 | 플라이 식품 성분 | |
| 초파리 한천 | Genesee | 66-111 | 플라이 식품 성분 |
| 에탄올 | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | 플라이 식품 성분 |
| 플라이 라인: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | 친절한 선물 | |
| 플라이 라인: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| 플라이 라인: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | 친절한 선물 | |
| 플라이 라인: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | 친절한 선물 | |
| 플라이 라인: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| 범용 단조 황동 레귤레이터 | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| 녹색 초파리 튜빙 | Genesee | 59-124 | |
| 열전달 화합물 | MG Chemicals | 860-60G | |
| 방열판 | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | 12.9 x 5.5 cm로 크기 조정 |
| 기 | AmScope | LED-6W | |
| 비활성 건조 효모 | Genesee | 62-108 | 플라이 식품 성분 |
| 인큐베이터 | Pervical | DR-41VL | 밝음: 어두운 주기: 12h:12h; 온도: 25 > C; 습도 : 40-50 % RH. |
| 메틸-4-하이드록시벤조에이 | 트 Thermo Scientific | 126965000 | 플라이 푸드 재료 |
| 마이크로 커버 유리 | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| 네일 폴리 | Kleancolor | ||
| 좁은 초파리 바이알 | Genesee | 32-113RL | |
| 목표 | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| 펠티에 냉각 모듈 | TE 기술 | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30mm |
| 플러그 | Genesee | 49-102 | |
| 전원 공급 장치 | 회로 전문가 | CSI1802X | 10볼트 DC 2.0 암페어 선형 벤치 전원 공급 장치 |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | 시리즈 4750, 크기 2 | |
| 나트륨 칼륨 L-타르타르산염 테트라하이드레이트 | Thermo Scientific | 033241-36 | 플라이 푸드 성분 |
| 스테이지 삽입물 | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| 스테레오 현미경 | Olympus | SZ61 | 모든 스테레오 현미경 작동 |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| 열전대 데이터 수집 장치 | 측정 컴퓨팅 | USB-2001-TC | 단일 채널 |
| 열전대 마이크로프로브 | Physitemp | IT-24P | |
| 노란색 옥수수 가루 | Genesee | 62-101 | 플라이 식품 성분 |
| Z축 피에조 스테이지 | Wienecke 및 Sinske | 432339-9000-000 |
참고문헌
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y.....
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재인쇄 및 허가
