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방법 논문

Normothermic Ex-Situ 관류 이종 심장 이식의 쥐 모델

2.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64954

⸱

2023년 4월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

여기에서 우리는 쥐 모델에서 정상 체온 상피 보존 후 이종 국소 이식된 심장의 평가 프로토콜을 제시합니다.

초록

심장 이식은 말기 심부전에 가장 효과적인 치료법입니다. 치료 적 접근과 개입의 개선에도 불구하고 이식을 기다리는 심부전 환자의 수는 여전히 증가하고 있습니다. 정상 체온 제자리 보존 기술은 기존의 정적 냉장 보관 기술에 필적하는 방법으로 확립되었습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 기증자 심장이 생리적 조건에서 최대 12시간 동안 보존될 수 있다는 것입니다. 또한, 이 기술은 순환기 사망 후 기증자 심장의 소생을 허용하고 이식 후 기증자 기능을 개선하기 위해 필요한 약리학적 개입을 적용합니다. 정상 체온 현장 보존 기술을 개선하고 보존 관련 합병증을 제거하기 위해 수많은 동물 모델이 확립되었습니다. 대형 동물 모델은 소형 동물 모델에 비해 다루기 쉽지만 비용이 많이 들고 까다롭습니다. 우리는 이종 복부 이식에 이어 정상 체온 제자리 기증자 심장 보존의 쥐 모델을 제시합니다. 이 모델은 비교적 저렴하며 단일 실험자가 수행할 수 있습니다.

서론

심장 이식은 난치성 심부전에 대한 유일한 실행 가능한 치료법으로 남아 있습니다 1,2,3,4. 심장 이식이 필요한 환자의 수가 꾸준히 증가하고 있음에도 불구하고 기증자 장기의 가용성에 비례하여 증가하는 것은 관찰되지 않았습니다5. 이 문제를 해결하기 위해 문제를 개선하고 기증자의 가용성을 높이는 것을 목표로 기증자의 심장을 보존하기 위한 새로운 접근 방식이 개발되었습니다6,7,8,9.

장기 관리 시스템(OCS) 기계를 사용하는 Normothermic ex situ heart perfusion(NESHP)이 임상 개입으로 등장했습니다 1,3. 이 기술은 종래의 정적 냉장 저장(SCS) 방법(2,9)에 대한 적절한 대안으로 간주되었다. NESHP는 한랭 허혈의 지속 기간을 효과적으로 줄이고, 대사 요구를 감소시키며, 기증자 장기를 운반하는 동안 최적의 영양 공급 및 산소 공급을 촉진합니다10,11. 기증자 장기 보존을 개선할 수 있는 이 방법의 분명한 잠재력에도 불구하고 임상 적용 및 추가 조사는 높은 비용으로 인해 제한되었습니다. 따라서 NESHP의 전임상 동물 모델은 이 기술과 관련된 주요 기술적 과제를 식별하는 데 중요합니다12,13. 돼지와 랫트는 허혈성 내성 때문에 전임상 연구에서 선호되는 동물 모델이다9. 돼지 모델은 기초 및 중개 연구에 이상적이지만 높은 비용과 관리 및 유지 관리에 필요한 집약적인 노동으로 인해 제한적입니다. 대조적으로, 쥐 모델은 더 저렴하고 다루기 쉽다14.

본 연구에서는 이식 후 이식 상태에 대한 보존 기술의 영향을 평가하기 위해 NESHP의 단순화된 쥐 모델을 소개한 후 이종 심장 이식을 도입했습니다. 이 모델은 간단하고 비용 효율적이며 단일 실험자가 실행할 수 있습니다. 그림 1 은 절차의 개략도를 보여줍니다.

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프로토콜

전남대학교병원 실험동물연구센터 윤리위원회(승인번호. CNU IACUC - H - 2022-36)은 모든 동물 실험을 승인했습니다. 본 연구에 사용된 수컷 Sprague-Dawley 랫트(350-450 g)는 실험동물의 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 관리를 받았다. 쥐는 12시간 명암 주기로 온도 조절이 가능한 방에 수용되었으며 표준 음식과 물을 사용할 수 있었습니다.

1. 준비

참고: 한 명의 실험자가 모든 실험 절차를 수행할 수 있습니다.

  1. 수술 전에 산소 공급기, 펌프 및 관류 라인을 포함한 Langendorff 장치를 조립합니다(그림 2). 관류 회로를 식염수 20mL로 채우고 자가 혈액으로 프라이밍될 때까지 순환시킵니다.
    알림: 이 단계의 목적은 체외 회로를 따뜻하게 하는 것입니다.
  2. 대동맥 캐뉼라에 부착된 스톱콕을 통해 심정지 라인을 회로에 부착하고 최종 심정지 주입을 위해 주사기 펌프를 준비합니다.
    알림: 관류 회로와 심정지 라인에서 기포가 제거되었는지 확인하십시오.
  3. 기증자 심장이 저장될 저장소 내에 온도 센서를 배치하고 회로의 온도를 37°C로 유지합니다.
  4. 수술 준비
    1. 각 기증자와 수혜자 쥐를 위해 별도의 멸균 미세 기구 및 재료 세트를 준비합니다.
      1. 기증자를 위한 수술 세트 준비: 수술용 가위 한 쌍, 마이크로 집게 한 쌍, 날카로운 모기 집게, 5-0 실크 봉합사, 면봉, 50mL 주사기, 심정지 용액(CPS)용 관류 라인, 주사기 펌프, 18G 혈관 카테터, 5 Fr. 대퇴 카테터 및 멸균 거즈.
      2. 수혜자를 위한 수술 세트를 준비합니다: 미세 수술용 가위, 상처 견인기, 미세 집게 한 쌍, 모기 겸자, 혈관 마이크로 클램프, 1mL 주사기, 5-0 및 9-0 폴리프로필렌 봉합사 1개, 5-0 실크 봉합사, 면봉 및 멸균 거즈.

2. 기증자 심장 보존 및 채혈

  1. 마취실에서 이소플루란(5%)으로 기증자 쥐의 마취를 유도하고 쥐의 체중을 기록한 후 수술대에 올려 놓습니다.
  2. 쥐를 수술대 위의 앙와위 자세로 놓고 노즈콘을 통해 90% 산소와 함께 2%-2.5% 이소플루란을 전달하여 지속적인 마취를 시행합니다.
  3. 발가락 핀치에 대한 반응 부족과 분당 50-60 사이 여야하는 호흡 빈도를 확인하여 마취 깊이를 확인하십시오.
    참고: 적절한 수준의 마취는 기증자 쥐에게 불필요한 스트레스와 통증을 피하는 데 중요합니다.
  4. 눈 윤활제를 바르고 수술이 수행될 쇄골에 치골 부위를 면도합니다. 요오드 기반 스크럽과 70% 알코올로 해당 부위를 청소하십시오.
  5. 카테터 삽입
    1. 7cm의 정중선 복부 절개와 검상돌기에서 쇄골 중간까지 3cm를 측정하는 양측 절개를 합니다. 흉부 부위에서 펠트를 제거하십시오.
    2. 면봉을 사용하여 복부 장기를 복부 왼쪽으로 동원합니다. 복부 대동맥을 후 복막 근막과 지방 조직에서 분리하십시오.
    3. 0.3mL의 등장성 식염수에 용해된 1,000IU 헤파린을 1mL 주사기를 사용하여 하대정맥(IVC)을 통해 주입합니다. 면봉으로 부드럽게 눌러 바늘 구멍에서 출혈을 막으십시오.
      알림: 주사 중 공기 색전증은 심정지로 이어질 수 있으므로 주의하십시오.
    4. 복부 대동맥(Abd. A)에 5 Fr. 대퇴 카테터를 삽입합니다. 카테터 팁이 대동맥궁에 도달하는지 확인합니다. 카테터의 삽입 된 부분의 대략적인 길이를 평가하여 카테터 위치를 확인하십시오.
  6. 채혈
    1. Abd에 삽입된 카테터를 통해 약 10mL의 혈액을 수집합니다.
    2. 나중에, 총 부피가 12mL에 도달 할 때까지 프라이밍 혈액을 등장 성 식염수로 희석하십시오. 0.3mL의 식염수와 인슐린 (20IU)에 용해 된 5mg의 세파졸린을 첨가하십시오.
  7. 심장 마비
    1. 미리 준비한 CPS 관류 라인을 복부 카테터에 연결하고 주사기 펌프로 800mL/h의 속도로 CPS 투여를 시작합니다.
    2. 횡격막에서 흉강을 열고 심실 팽창을 방지하기 위해 횡격막 가까이에 IVC를 절단합니다. 흉추를 따라 흉추 입구까지 갈비뼈를 양측으로 자릅니다. 동원 된 복부 흉벽을 모기 집게로 우월하게 반사하십시오.
    3. 대동맥궁을 시각화하기 위해 마이크로 집게를 사용하여 흉선을 완전히 제거합니다. 흉선 동맥에서 출혈이 생기면 가벼운 압박을 가하십시오.
  8. 추출
    1. 모든 CPS를 투여 한 후 대동맥 궁을 주변 조직과 분리하십시오. 왼쪽 쇄골 하 동맥 바로 아래를 조심스럽게 해부하십시오.
    2. 상완 뇌관을 절제하고 먼 위치에 일반적인 경동맥을 남겨두고 대동맥 캐뉼러 삽입 중에 쉽게 다룰 수 있도록 대동맥궁의 더 긴 그루터기를 남겨 둡니다. 주요 폐동맥 (MPA)을 가능한 한 분기점에 가깝게 횡단하십시오. 왼쪽 심방 부속기가 손상되지 않도록주의하십시오.
    3. 5-0 실크 봉합사로 상대정맥(SVC)과 IVC를 조심스럽게 결찰하여 우심방(RA)과 관상동이 막히는 것을 방지합니다. 흉부의 왼쪽 가장자리를 젖은 거즈로 덮고 심장을 그 위에 놓고 SVC 및 IVC 합자를 부드럽게 수축시켜 문턱을 노출시킵니다.
    4. 폐정맥과 azygos 정맥을 5-0 실크 봉합사와 함께 합자합니다. 등쪽 조직을 합자까지 절단하고 심장을 추출합니다. 심장에 부상이 있는지 검사하십시오. 마지막으로, 대동맥 캐뉼러 삽입 전에 심장의 무게를 잰다.

3. 현장 관류

  1. 대동맥 캐뉼라 삽입 및 관류
    1. 대동맥 캐뉼러를 삽입하기 전에 식염수 프라이밍 회로를 혈액 프라이밍으로 교체하십시오.
    2. 대동맥 캐뉼라를 대동맥궁에 삽입하고 임시 마이크로 클램프로 고정합니다. 캐뉼라의 끝이 상완 세포질 접합부에 위치하는지 확인하십시오.
    3. 마이크로 집게로 대동맥을 부드럽게 잡아 캐뉼라의 정확한 위치를 확인하십시오.
    4. 2-3mL/min의 유속으로 관류를 시작하여 관류액이 캐뉼레이션 부위에서 누출되어 기포를 제거합니다.
    5. 모니터링 시스템에 연결된 센서를 통해 관류 압력과 온도를 모니터링합니다.
    6. 정맥혈이 주요 폐동맥 (MPA)에서 누출 될 때까지 첫 번째 손가락과 집게 손가락으로 심장을 부드럽게 마사지하십시오.
    7. 1-0 실크 합자로 대동맥을 고정하고 모든 설정(관류 회로, 관류 압력, 온도)을 확인한 후 클램프를 제거합니다.
    8. 영구 합자가 배치되면 심장이 몇 초 안에 수축하기 시작하고 60초 안에 정상 리듬에 도달하는지 확인합니다. 37°C에서 3-4mL의 관상동맥 유속과 55-65mmHg의 평균 관류압은 적절한 관류를 나타냅니다.
    9. 저장소에서 0.15mL의 혈액을 수집하고 관류 시작 시와 그 후 20분마다 혈액 가스 분석(BGA)을 확인합니다. 관류 동안 pH, pCO2,pO2, 글루코스, 헤마토크릿, 칼륨 및 젖산염을 모니터링하고 기록합니다. 120분 관류 후 주사기 펌프를 통해 3mL의 Custodiol을 250mL/h의 속도로 투여하여 심장을 정지시킵니다.

4. 이식

  1. 수혜자의 준비
    1. 현장 관류가 중단되기 30분 전에 수용자 준비를 시작합니다.
    2. 2.2 단계에서 언급 한 것과 동일한 방법을 사용하여 수용자 동물을 마취시킵니다.
    3. 쥐를 가열 패드에 앙와위 자세로 놓고 온도 프로브를 직장에 삽입하여 체온을 37°C로 유지합니다.
    4. 눈 윤활제를 바르고 상복부 부위의 음모를 면도하고 요오드 기반 스크럽과 70% 알코올로 해당 부위를 정화합니다.
  2. 약물
    1. 수술 중 손실된 체액을 보충하기 위해 따뜻한 식염수 2mL를 피하 주사합니다. 헤파린 200IU를 피하 주사합니다.
    2. 식염수 0.3mL에 용해된 세파졸린 10mg/kg을 피하 또는 근육주사하여 항생제 예방을 시행한다.
    3. 디클로페낙 20mg/kg을 피하 주사하여 통증 조절을 시행합니다.
  3. 중간 선 개복술을 수행하고 복강을 넓히기 위해 견인기를 삽입하십시오. 면봉을 사용하여 수혜자의 왼쪽으로 복부 장기를 동원하여 시술을 위한 공간을 만듭니다.
  4. 복부 장기를 따뜻하고 젖은 거즈로 감싸서 탈수를 예방하십시오. 수술 중 50mL 주사기로 따뜻한 식염수를 간헐적으로 뿌립니다.
  5. 10배 배율의 수술용 현미경을 사용하여 십이지장과 근위 공장을 면봉으로 둔기로 해부하여 Abd. A. 및 IVC를 노출시킵니다. Abd를 준비합니다. A 및 IVC를 문합하고, 도 3 또는 이전에 문서화된 방법15에 따라 기증자 심장을 체계적으로 이식한다.
    알림: Abd. A.와 IVC를 분리하지 마십시오.
    1. 혈관 문합이 신장 내하에 배치된다고 가정하면 클램핑을 위해 대동맥과 IVC의 충분한 부분을 준비하십시오.
    2. 면봉이나 날카로운 톱니 모양의 집게를 사용하여 혈관 주변의 지방과 근막을 제거하기 위해 둔기 준비를하십시오.
    3. 5-0 실크 합자를 장간막 가지와 주요 혈관의 두개골과 꼬리 쪽에 놓습니다. 복부 혈관을 높이고 5-0 실크 봉합사로 요추 가지를 응고 시키거나 결찰합니다. 고환 동맥과 정맥을 아끼고 고정하지 마십시오.
    4. 합자를 사용하여 혈관을 들어 올리고 마이크로 클램프를 주요 혈관의 장간막 가지, 꼬리 및 두개골 쪽에 배치하여 문합 부위의 혈류를 중지합니다. cl을 배치하기 전에 가열 패드를 끄십시오.amps, 과도한 가열은 사지 허혈을 악화시킬 수 있습니다. 저체온증을 피하기 위해 용기를 디클램핑한 후 가열 패드를 켜야 합니다.
    5. 27G 바늘을 사용하여 대동맥을 뚫고 미세 가위로 절개 부위를 기증자 상행 대동맥의 개구부와 같거나 약간 큰 길이로 늘립니다(Asc. A), 이는 약 5mm입니다.
    6. 대동맥 절개술과 같은 방법으로 IVC에 세로 절개를하되 대동맥 절개에 비해 꼬리 쪽에 3mm 더 가깝게 만듭니다.
    7. 문합을 시작하고, 기증자 심장을 수혜자의 복부 오른쪽에 놓고 기증자 Asc를 부착합니다. A를 받는 사람의 Abd에게. 세로 절개의 두개골 모서리에 하나의 단순 중단 스티치(9-0 폴리프로필렌)가 있는 A.
    8. 심장을 수혜자 복부의 왼쪽으로 옮기고 기증자의 Asc의 문합을 수행합니다. 수신자의 Abd가 있는 A. 달리는 9-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하는 A.
    9. 세로 절개의 꼬리와 두개골 모서리에 두 개의 중단된 봉합사(9-0 폴리프로필렌)를 사용하여 기증자 폐동맥을 IVC에 고정합니다.
    10. 혈관의 관내 측에서 정맥 문합의 전반부를 수행하고 혈관의 관외 측에서 후반부를 완료하십시오. 매듭을 조이기 전에 공기 색전증을 예방하기 위해 식염수로 필드를 씻어 내십시오.
  6. 디에어링 및 디클램핑
    1. 문합을 완료한 후 먼저 장간막 정맥 클램프를 제거하여 심장의 오른쪽이 정맥혈로 채워지도록 합니다.
    2. 관상 동맥 회로와 Asc의 공기를 제거하십시오. A. 몇 초 동안 역행성 관상동맥 관류를 적용합니다.
    3. 혈관의 양쪽에 거즈 조각을 놓고 꼬리 클램프와 두개골 클램프를 제거하십시오.
    4. 면봉으로 1-2분 동안 부드럽게 압축합니다. 적절한 지혈을 한 후 면봉을 제거하고 따뜻한 식염수로 문합을 씻으십시오.
      알림: 심장은 재관류 후 1분 이내에 박동을 시작해야 합니다. 수혜자의 체온이 35 °C 미만이면 온도가 36 °C에 도달 한 후 심장 리듬이 정상화됩니다.
  7. 구불 구불 한 방식으로 복부 장기를 교체하고 연속 5-0 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 복부 절개 층을 닫습니다.
  8. 수술 후 체온이 37°C에 도달할 때까지 마취된 동물을 온열 패드 위의 깨끗한 부위에 놓습니다.
    알림: 체온이 37°C에 도달할 때까지 수술 후 검사를 시작하지 마십시오. 실험이 끝날 때까지 2-2.5% 이소플루란에서 마취를 유지하십시오.
  9. 이식 된 기증자 심장의 ECG를 3 시간 동안 모니터링합니다. 그런 다음 조직학적 연구를 위해 심부 마취 상태에서 심장을 절제합니다.
    참고: 심장을 절제하기 전에 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 절차와 ECG 모니터링은 6시간 미만이 소요됩니다. 수술 전후 투여되는 디클로페낙(4.2.3단계)은 이 절차의 전체 기간 동안 통증 관리를 가능하게 합니다. 진통 요법은 기관 동물 사용 지침에 따라 조정할 수 있습니다.

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결과

도 1 은 소동물모델에 사용된 실험설계를 예시한다. 그림 2 는 소형 동물 산소 공급기를 포함하는 변형된 Langendorff 관류 장치를 표시합니다. heterotopic 복부 이식에 대한 문합의 순서는 그림 3에 나와 있습니다.

그림 4 는 젖산, 칼륨 및 평균 대동맥압과 같은 제자리 관류 동안 심장의 생존력을 평가하는 데 사용되는 매개변수를 보여줍니다. 이 연구에서 정상 체온 제자리 보존을 사용하면 6건의 성공적인 사례의 총 허혈 시간이 46.2분± 4.7분으로 감소한 반면 총 체외 시간은 166.2분± 4.7분으로 감소했습니다(그림 5). 기증자로부터 심장을 추출하고 현...

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토론

이 모델을 확립하는 데 중점을 둔 것은 정상 체온 인간 심장 이식을 복제하는 것이었습니다. 비-배출 모델은 현장 환경( ex situ environment)에서 기증자 심장을 보존하기 위해 일반적으로 선호되는 기술이다(16). 배출 모델은 제자리 관류 동안 심장 기능을 평가하는 데 많은 이점을 제공하지만(17), 이종 이식 모델에는 적합하지 않습니다. 이종 이식에서 이식된 기증자 심장은 수혜자 순환계에서 숙주 심장에 의해 생성된 수축기 후부하 압력을 극복해야 하며, 이는 평가에서 기증자의 심장 성능이 제한되고 과소평가로 이어진다18. 따라서, 비 배출 모델은 이종 이식에서 더 유리하다. 비 박출 모델에서 기증자 심장은 관류되지만 수혜자의 순환을 지원하지 않아 심장의 성능 평가가 크게 제한됩니다. 조직학적 염색 및 블로팅 분석과 같은 형태학적 및 분자적 평가는 기능 평가가...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 전남대학교병원 의생명연구소의 보조금 B2021-0991과 한국연구재단의 NRF-2020R1F1A1073921의 지원을 받았습니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AES 능동 대피 시스템Smiths medicalPC-6769-51ACO2 및 초과 이소플루란
마취기Smiths medicalPC-8801-01A이소플루란과 옥시에겐을 혼합하여 동물
B20 환자 모니터GE 의료 시스템B20에 전달하여 평균 대동맥 압력 및 온도를 관찰 항
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현미경AmscopeMU1403확대/축소 수술용 분야 (수신자)
외과 확대경SurgiTelL2S09확대 수술 분야 (기증자)
주사기 펌프AMP 모두SP-8800심마비 용액을 전달하기 위해
천음속 유량 센서 천음속ME3PXL-M5관류 회로 유량 센서
천음속 튜브 유량 모듈천음속TS410유량 획득 시스템
왓슨 - Marlow pumpsHarvard apparatus010.6131.DAOrecirculate perfusate에 사용되는 연동 펌프
WBC-1510AJEIO TECHHeating bath
Sprague-Dawley ratsSamtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye DropsSENTRIX Animal care눈을 위한 젖은 연고
CefazolinJW 제약prophilaxis
CustodiolDR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH심장 수확
DiclofenacMyungmoon Pharm. Co. Ltd통증 조절을 위해
HeparinJW 제약항응고제
인슐린JW 제약요법
식염수JW제약하이드레이션 테라피용
활용 세트 E03056D 호르몬 :

참고문헌

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  20. Qi, X., et al. The evaluation of constant coronary artery flow versus constant coronary perfusion pressure during normothermic ex-situ heart perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 41 (12), 1738-1750 (2022).
  21. Okahara, S., et al. A novel blood viscosity estimation method based on pressure-flow characteristics of an oxygenator during cardiopulmonary bypass. Artificial Organs. 41 (3), 262-266 (2017).
  22. Quader, M., Torrado, J. F., Mangino, M. J., Toldo, S. Temperature and flow rate limit the optimal ex-vivo perfusion of the heart - an experimental study. Journal of Cardiothoracic Surgery. 15 (1), 180(2020).

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정오


Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.

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