여기에서 우리는 쥐 모델에서 정상 체온 상피 보존 후 이종 국소 이식된 심장의 평가 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
Normothermic Ex-Situ 관류 이종 심장 이식의 쥐 모델
* These authors contributed equally
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
심장 이식은 말기 심부전에 가장 효과적인 치료법입니다. 치료 적 접근과 개입의 개선에도 불구하고 이식을 기다리는 심부전 환자의 수는 여전히 증가하고 있습니다. 정상 체온 제자리 보존 기술은 기존의 정적 냉장 보관 기술에 필적하는 방법으로 확립되었습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 기증자 심장이 생리적 조건에서 최대 12시간 동안 보존될 수 있다는 것입니다. 또한, 이 기술은 순환기 사망 후 기증자 심장의 소생을 허용하고 이식 후 기증자 기능을 개선하기 위해 필요한 약리학적 개입을 적용합니다. 정상 체온 현장 보존 기술을 개선하고 보존 관련 합병증을 제거하기 위해 수많은 동물 모델이 확립되었습니다. 대형 동물 모델은 소형 동물 모델에 비해 다루기 쉽지만 비용이 많이 들고 까다롭습니다. 우리는 이종 복부 이식에 이어 정상 체온 제자리 기증자 심장 보존의 쥐 모델을 제시합니다. 이 모델은 비교적 저렴하며 단일 실험자가 수행할 수 있습니다.
서론
심장 이식은 난치성 심부전에 대한 유일한 실행 가능한 치료법으로 남아 있습니다 1,2,3,4. 심장 이식이 필요한 환자의 수가 꾸준히 증가하고 있음에도 불구하고 기증자 장기의 가용성에 비례하여 증가하는 것은 관찰되지 않았습니다5. 이 문제를 해결하기 위해 문제를 개선하고 기증자의 가용성을 높이는 것을 목표로 기증자의 심장을 보존하기 위한 새로운 접근 방식이 개발되었습니다6,7,8,9.
장기 관리 시스템(OCS) 기계를 사용하는 Normothermic ex situ heart perfusion(NESHP)이 임상 개입으로 등장했습니다 1,3....
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프로토콜
전남대학교병원 실험동물연구센터 윤리위원회(승인번호. CNU IACUC - H - 2022-36)은 모든 동물 실험을 승인했습니다. 본 연구에 사용된 수컷 Sprague-Dawley 랫트(350-450 g)는 실험동물의 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 관리를 받았다. 쥐는 12시간 명암 주기로 온도 조절이 가능한 방에 수용되었으며 표준 음식과 물을 사용할 수 있었습니다.
1. 준비
참고: 한 명의 실험자가 모든 실험 절차를 수행할 수 있습니다.
- 수술 전에 산소 공급기, 펌프 및 관류 라인을 포함한 Langendorff 장치를 조립합니다(그림 2). 관류 회로를 식염수 20mL로 채우고 자가 혈액으로 프라이밍될 때까지 순환시킵니다.
알림: 이 단계의 목적은 체외 회로를 따뜻하게 하는 것입니다. - 대동맥 캐뉼라에 부착된 스톱콕을 통해 심정지 라인을 회로에 부착하고 최종 심정지 주입을 위해 주사기 펌프를 준비합니다.
알림: 관류 회로와 심정지 라인에서 기포가 제거되었는지 확인하십시오. - 기증자 심장이 저장될 저장소 내에 온도 센서를 배....
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결과
도 1 은 소동물모델에 사용된 실험설계를 예시한다. 그림 2 는 소형 동물 산소 공급기를 포함하는 변형된 Langendorff 관류 장치를 표시합니다. heterotopic 복부 이식에 대한 문합의 순서는 그림 3에 나와 있습니다.
그림 4 는 젖산, 칼륨 및 평균 대동맥압과 같은 제자리 관류 동안 심장의 생존력을 평가하는 데 사용되는 매개변수를 보여줍니다. 이 연구에서 정상 체온 제자리 보존을 사용하면 6건의 성공적인 사례의 총 허혈 시간이 46.2분± 4.7분으로 감소한 반면 총 체외 시간은 166.2분± 4.7분으로 감소했습니다(그림 5). 기증자로부터 심장을 추출하고 현.......
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토론
이 모델을 확립하는 데 중점을 둔 것은 정상 체온 인간 심장 이식을 복제하는 것이었습니다. 비-배출 모델은 현장 환경( ex situ environment)에서 기증자 심장을 보존하기 위해 일반적으로 선호되는 기술이다(16). 배출 모델은 제자리 관류 동안 심장 기능을 평가하는 데 많은 이점을 제공하지만(17), 이종 이식 모델에는 적합하지 않습니다. 이종 이식에서 이식된 기증자 심장은 수혜자 순환계에서 숙주 심장에 의해 생성된 수축기 후부하 압력을 극복해야 하며, 이는 평가에서 기증자의 심장 성능이 제한되고 과소평가로 이어진다18. 따라서, 비 배출 모델은 이종 이식에서 더 유리하다. 비 박출 모델에서 기증자 심장은 관류되지만 수혜자의 순환을 지원하지 않아 심장의 성능 평가가 크게 제한됩니다. 조직학적 염색 및 블로팅 분석과 같은 형태학적 및 분자적 평가는 기능 평가가.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 전남대학교병원 의생명연구소의 보조금 B2021-0991과 한국연구재단의 NRF-2020R1F1A1073921의 지원을 받았습니다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AES 능동 대피 시스템 | Smiths medical | PC-6769-51A | CO2 및 초과 이소플루란 |
| 마취기 | Smiths medical | PC-8801-01A | 이소플루란과 옥시에겐을 혼합하여 동물 |
| B20 환자 모니터 | GE 의료 시스템 | B20 | 에 전달하여 평균 대동맥 압력 및 온도를 관찰 항 |
| 상성 모니터링 시스템 | 하버드 장치 | 55-7020 | 동물의 온도를 모니터링하고 유지하기 위해 |
| Micro-1 쥐 산소 공급기 | Dongguan Kewei 의료 기기 | Micro-MO | langendorff 회로의 가스 교환용 |
| 미세 천자 도입기 복 | 부 대동맥을 통해 심정지 용액을 아치에 전달하기 위한 | COOK 의료 | G48007 |
| 현미경 | Amscope | MU1403 | 확대/축소 수술용 분야 (수신자) |
| 외과 확대경 | SurgiTel | L2S09 | 확대 수술 분야 (기증자) |
| 주사기 펌프 | AMP 모두 | SP-8800 | 심마비 용액을 전달하기 위해 |
| 천음속 유량 센서 천음속 | ME3PXL-M5 | 관류 회로 유량 센서 | |
| 천음속 튜브 유량 모듈 | 천음속 | TS410 | 유량 획득 시스템 |
| 왓슨 - Marlow pumps | Harvard apparatus | 010.6131.DAO | recirculate perfusate에 사용되는 연동 펌프 |
| WBC-1510A | JEIO TECH | Heating bath | |
| Sprague-Dawley rats | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea | ||
| Medications | |||
| BioHAnce Gel Eye Drops | SENTRIX Animal care | 눈을 위한 젖은 연고 | |
| Cefazolin | JW 제약 | prophilaxis | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | 심장 수확 | |
| Diclofenac | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | 통증 조절을 위해 | |
| Heparin | JW 제약 | 항응고제 | |
| 인슐린 | JW 제약 | 요법 | |
| 식염수 | JW제약 | 하이드레이션 테라피용 |
참고문헌
- Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
- Ardehali, A., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
