방법 논문

파리 겹눈의 광학, 생리학 및 생화학을 연구하는 방법

2023년 3월 24일

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. 집파리 겹눈의 시각 공간 자동 차트. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (181), e63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (179), e63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. 초파리 광수용체의 광색소 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (184), e63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. 내인성 초파리 일시적 수용체 전위 채널의 정화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (178), e63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. 질량 분석을 사용한 초파리 광수용체의 지질 신호 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (181), e63516 (2022).

사설

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파리 겹안은 근본적인 생물학적 메커니즘을 밝히기 위한 중요한 생물학적 모델 시스템입니다. 이 시스템을 사용하여 연구된 메커니즘 중 일부는 다음과 같습니다: 거의 파노라마 시야를 가진 겹눈 시력1; 빛에 민감한 G-단백질 결합 수용체의 생물물리학, 단백질 조립 및 생물 발생 2,3,4; 포스포리파제 Cβ-매개 신호 전달 시스템 5,6; 천연 조직에서의 TRP 채널 활성화 및 조절 5,6; 다중 단백질 신호 전달 복합체의 조립 및 기능 7,8; 분자 구조, 생화학 및 이노시톨-인지질 재활용의 기능 9,10; 및 신호 전달 단백질의 신호 매개 세포내 전좌11,12. 파리 겹안의 독특한 해부학적 구조와 광학이 광범위하게 연구되어 근본적인 발달 메커니즘과 시각 능력이 밝혀졌습니다.

이 방법 모음은 파리 겹안에서 위의 메커니즘 중 일부를 연구하기 위한 방법을 개발하고 개선한 선도적인 과학자들의 작업으로 구성됩니다. Muñoz et al. 겹눈과 그 공간 조직의 정확한 묘사를 제공하는 플라이 눈의 광학 배열을 정량적으로 분석하는 방법을 설명합니다13. 이 방법은 시각 정보의 신경 처리를 자세히 연구하는 데 필수적입니다. 중요한 것은 생체에서 영감을 받은 인공 눈을 생산하려는 많은 시도가 있었고 이는 기존 겹안에 대한 정량적 연구에 의존해 왔다는 것입니다. Wagner et al. 겹눈의 독특한 광학 현상인 깊은 가동공과 각막의 광학 중화와 함께 고증폭 현미경을 활용하여 초파리 광수용체 세포 내에서 eGFP 태그 단백질을 국소화합니다14. 이 방법을 사용하면 광수용체 변성과 중요한 신호 전달 단백질의 세포 국소화 및 트래피킹으로 인한 횡문류의 구조적 결함을 검출할 수 있습니다. Gutorov et al. 전체 눈 또는 단일 광수용체 세포의 전기생리학적 측정을 활용하여 생체 내 광색소 상태의 수준과 신호 전달 단백질의 특정 돌연변이에 의한 조절을 측정합니다15. 이 방법은 광자 흡수에 의해 유도된 시각적 안료 상태(R) 내의 전하 변위를 이용하여 어둠 속에서도 안정적인 두 번째 안료 상태(M)를 형성합니다. 추가 방법은 시각 색소의 어두운 이중 안정 특성과 플라이 R 및 M 상태의 흡수 스펙트럼의 차이를 이용하는 PDA(Light-off 후 연장된 탈분극)를 사용합니다. PDA는 다량의 광색소의 전환에 의존하기 때문에 광색소의 생합성에 아주 작은 결함이라도 쉽게 감지할 수 있는 비정상적인 PDA로 이어질 수 있습니다. 실제로 비정상적인 PDA를 나타내는 초파리 돌연변이체는 새로운 신호 단백질의 발견으로 이어졌습니다. 이에 대한 뛰어난 예는 스캐폴드 단백질 불활성화로 구성된 새로운 단백질 복합체의 발견이지만 후전위 D(INAD), 안구 특이적 단백질 키나아제 C(eyePKC), 포스포리파제 Cβ(PLCβ) 및 일시적 수용체 전위(TRP) 채널. 처음으로 Liu et al. 초 파리 TRP 채널16을 정제하는 기술을 제시합니다. 이 변형된 친화성 정제 방법은 INAD 신호 전달 복합체의 조립 메커니즘을 기반으로 하는 경쟁 전략을 사용합니다. 이 전략은 내인성 TRP 채널의 정제를 가능하게 합니다. 이 방법에 따르면, 먼저 Ni-비드에 결합된 PLCβ 단편을 히스티딘으로 태그하고 초파리 머리 균질산물에서 얻은 내인성 INAD 단백질 복합체를 끌어내리는 데 사용됩니다. 다음으로, 과도하게 정제된 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)로 태그된 TRP 단편을 Ni-비드에 첨가하여 INAD에 결합된 내인성 TRP 채널과 경쟁합니다. 마지막으로, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 상청액에서 태그가 지정된 TRP 채널 단편을 내인성 TRP 채널에서 분리합니다. Panda et al. 질량 분석법을 사용하여 초 파리 광수용체 세포에서 여러 종류의 지질을 식별하고 정량화하는 민감한 기술을 보고합니다17. PLCβ의 활성화는 표면막에서 포스파티딜이노시톨 4,5 중인산(PI(4,5)P2)의 가수분해로 이어지기 때문에 광형질 전달에 매우 중요합니다. 이 반응은 궁극적으로 TRP 채널의 활성화로 이어집니다. 또한 PLCβ 활성은 많은 지질 종의 생성을 초래합니다. 이러한 지질 종 중 일부는 TRP 활성화에 참여하고 감각 전달을 최적화하기 위한 광수용체의 기능적 조직에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안되었습니다. Panda et al.17의 연구에서 이러한 발견은 특정 지질 수준을 조절하는 결함이 있는 효소를 보유한 초파리 돌연변이를 분리하여 평가되었습니다.

파리 겹안은 생물학의 기본 메커니즘을 밝히는 데 유용한 실험 시스템입니다. 초파리 에서 개발된 강력한 유전 방법론은 파리 광전달과 관련된 신호 전달 단백질을 분석하고 발견하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법 모음은 겹안의 해부학적 및 광학 분석과 광수용체 세포의 분자 성분 및 생화학 반응을 포함하여 파리 시력의 기본 메커니즘을 조사하기 위한 주요 기술을 자세히 설명합니다. 비디오 기사에는 이러한 방법론의 내재된 어려움에 대한 중요한 조언도 포함되어 있습니다. 이 방법 수집은 이러한 기술이 다른 생물학적 제제에 적용될 수 있기 때문에 이 연구 분야 외부의 과학자에게도 유익해야 합니다.

공개 사항

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감사의 글

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참고문헌

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  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
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  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

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