우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표는 개별 뉴런 수준에서 전체 뇌 회로에 이르기까지 신경 역학에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 그러나 신경 반응은 이전 경험, 내부 상태 또는 확률적 요인으로 인해 달라질 수 있으므로 한 번에 많은 개인의 신경 기능을 평가할 수 있는 방법이 필요합니다. 대부분의 기록 기술은 한 번에 한 마리의 동물을 검사하는 반면, 우리는 광시야 현미경을 사용하여 한 번에 수십 개의 예쁜꼬마선충 또는 기타 서브밀리미터 규모의 유기체로 신경 기록을 확장하는 방법을 설명합니다. 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어는 화학적, 광학적, 기계적, 열적 및 전자기 자극을 포함한 다양한 자극 유형의 강도와 타이밍을 제어하는 완전 자동화된 실험을 프로그래밍하는 데 뛰어난 유연성을 제공합니다. 특히, 미세유체 유동 장치는 초 미만의 시간 분해능으로 화학감각 자극의 정밀하고 반복 가능하며 정량적인 제어를 제공합니다. 그런 다음 NeuroTracker 반자동 데이터 분석 파이프라인은 개별 및 인구 전체의 신경 반응을 추출하여 신경 흥분성 및 역학의 기능적 변화를 발견합니다. 이 논문은 뉴런 적응, 시간적 억제 및 자극 누화를 측정하는 예를 제시합니다. 이러한 기술은 자극의 정밀도와 반복성을 높이고, 개체군 변동성을 탐색할 수 있으며, 세포 및 오가노이드에서 전체 유기체 및 식물에 이르기까지 소규모 생물 시스템의 다른 동적 형광 신호로 일반화할 수 있습니다.
서론
칼슘 이미징 기술은 형광 현미경 및 표적 세포에서 발현된 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하여 실시간으로 생체 내 신경 역학을 비침습적으로 기록할 수 있게 해주었다 1,2,3. 이러한 센서는 일반적으로 GFP-칼모듈린-M13 펩타이드(GCaMP) 패밀리와 같은 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하여 신경 활성화 및 세포 내 칼슘 수치 상승 시 형광 강도를 증가시킵니다. 칼슘 이미징은 선충 C. elegans에서 뉴런과 신경 회로가 살아 있고 행동하는 동물 4,5,6,7,8,9,10에서 어떻게 기능하는지 조사하는 데 특히 강력했습니다. 이러한 기술은 종종 작은 물리적 규모에서 생물학적....
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프로토콜
1. 신경 영상 장비
참고: 현미경 조명 타이밍, 이미지 획득 및 자극 전달을 제어하는 이미징 및 자극 시스템 구축에 대한 자세한 지침은 Lawler 및 Albrecht15를 참조하십시오(그림 1). 저렴한 Arduino Nano 자극 컨트롤러는 디지털 신호를 통해 밸브 컨트롤러에 대한 유체 밸브를 작동시키고 LED 컨트롤러에 대한 아날로그 전압 신호를 통해 광유전학적 조명을 제어합니다. 진동 모터 및 열 히터와 같은 다른 자극은 디지털 또는 아날로그 신호를 사용하여 제어할 수 있습니다. 자극 컨트롤러는 오픈 소스 Micro-Manager 현미경 제어 소프트웨어(μManager)16에 의해 지정된 대로 카메라 신호를 통해 자극 및 이미지 기록을 동기화합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약, 장비 및 유기체와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- GFP 광학을 갖는 epifluorescence 현미경, 디지털 노출 출력 신호를 갖는 sCMOS 카메라, 및 자극 제어....
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결과
우리는 시간적 억제, 적응 및 탈억제를 포함하여 다양한 신경 현상을 평가하는 자극 패턴의 몇 가지 예를 제시합니다. 시간적 억제는 초기 발현 직후에 발생하는 두 번째 자극 제시에 대한 신경 반응의 일시적인 억제이다14. 이 현상을 테스트하기 위해 쌍 펄스 실험에서 0초에서 20초 범위의 간격으로 분리된 두 개의 1초 냄새 펄스로 구성된 8개의 패턴이 제시되었습니다(그림 6B, 해당 자극 제어 파일은 그림 3B 참조). 경기장은 단일 자극 유체(1.1μM 디아세틸), 완충액 및 제어 흐름 튜브로 설정되었으며 사용되지 않은 입구 포트는 단단한 핀으로 막혔습니다(그림 6A). 밸브 1을 켜면 제어 유체가 ctrl1 입구로 들어가 자극이 경기장으로 들어가도록 유체 흐름을 이동시킵니다. 밸브.......
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토론
이 프로토콜에서 우리는 다양한 자극 패턴의 시간적으로 정확한 전달을 사용하여 신경 활동 현상을 평가하기 위한 개방형 현미경 시스템을 설명합니다. 미세 유체 플랫폼은 수십 마리의 동물을 현미경 시야에 유지하면서 반복 가능한 자극을 전달합니다. 다양한 자극 타이밍 패턴을 쉽게 프로그래밍할 수 있는 상용 현미경 소프트웨어 패키지는 거의 없으며, 각 패턴 또는 독점 파일 형식을 수동으로 입력해야 하는 경우가 많습니다. 대조적으로, 실험은 이 시스템에서 텍스트 파일로 정의되며, 이는 컴퓨터로 생성될 수 있고 분석 소프트웨어에서 읽을 수 있습니다. 여기에서 우리는 다중 모드 자극 동안 시간적 억제, 적응 및 누화와 같은 신경 현상을 평가하기 위해 가변 자극 패턴을 사용하는 유용성을 보여줍니다. 데이터 분석 파이프라인은 대규모 현미경 비디오 파일을 인구 변동성(그림 5B), 시간 경과에 따른 변화(그림 7C 및 그림 8C, D).......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이러한 프로토콜을 테스트하고 원고를 검토해 주신 Fox Avery와 프로그래밍 지원을 요청해 주신 Eric Hall에게 감사드립니다. 본원에 제시된 방법에 대한 자금은 미국 국립과학재단(National Science Foundation 1724026, D.R.A.)에 의해 부분적으로 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>세균 균주 | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. 원하는 뉴런에서 GCaMP(및 선택적으로 Chrimson)를 발현하는 예쁜꼬마선><충 | Caenorhabditis Genetics Center(CGC) 또는 출판된 | 논문 NZ1091 | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical 자극 |
| 염화칼슘, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| 플루오레세인, 나트륨염 | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| 유리 방수 | Rain-X | Cat #800002250 | 유리 소수성 처리(일회용) |
| 마그네슘, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| 선충 성장 매체 (NGM) 한천 | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| 페트리 접시 (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| 폴리(디메틸 실록산)(PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| 인산칼륨 일염기 | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| 인산칼륨 이염기성 | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| 염화나트륨, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란(TFOCS) | 겔레스트 | CAS# 78560-45-9 | 유리 소수성 처리(내구성) |
| 소프트웨어 및 알고리즘 | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | ||
| 현미경 제어 소프트웨어 | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker 데이터 분석 소프트웨어 | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 도립 현미경 셋업 (GFP 필터 큐브, 5× 대물렌즈 또는 유사) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3방향 미니어처 디아프라그람 격리 밸브 (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | 밸브 1: 제어 |
| 2방향 상시 닫힘(NC) 핀치 밸브 | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | 밸브 2: 유출 |
| 3방향 핀치 밸브 | NResearch | Cat #161P091 | 밸브 3: 자극 |
| 선택: 광유전학적 자극 LED 및 컨트롤러(615nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S 및 #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 디지털/수동 밸브 컨트롤러 | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| 다양한 전선 및 커넥터 | Cell | STARS Protocol(Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel 가변 속도 로터리 커터 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | 유리 절단 속도를 5k RPM으로 설정 |
| Dremel 드릴 프레스 회전 도구 워크스테이션 | Dremel | Cat #220-01 | |
| 다이아몬드 드릴 비트 | Dremel | Cat #7134 | |
| 유리 슬라이드, 1 mm 두께 | VWR | Cat # 75799-268 | |
| 유리 스크라이브 (다이아몬드 스크라이버) | Ted Pella | Cat # 54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G 뭉툭한 바늘 | VWR | Cat # 89134-100 | |
| Microfluidic device | 이 기사와 관련된 CAD 파일에서 작성자 또는 제작 | 해당 없음 | |
| 미세유체 장치 클램프 | 워너 인스트루먼트(또는 기계 공장) | P-2 | |
| 미세유체 튜브, 0.02&프라임; ID | 콜-파머 | 캣 #EW-06419-01 | |
| 튜브 19 g, 0.5&프라임; | 뉴잉글랜드 소형 튜브 | 고양이 #NE-1027-12 |
참고문헌
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.
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재인쇄 및 허가
