방법 논문

프로그래밍된 죽음 리간드 1 발현 이미징을 위한 68갈륨 표지 D-펩타이드 PET 추적자 개발

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DOI:

10.3791/65047

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2023년 2월 3일

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1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 [68Ga] D-도데카펩티드 길항제의 양전자 방출 단층 촬영 이미징을 기반으로 전신에서 프로그래밍된 죽음 리간드 1의 분포를 평가하는 비침습적 실시간 방법을 개발했습니다. 이 기술은 기존의 면역조직화학에 비해 장점이 있으며 면역관문 차단 요법의 혜택을 받을 적절한 환자를 식별하는 효율성을 향상시킵니다.

초록

프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)/프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 기반으로 하는 면역 관문 차단 요법의 개발은 최근 몇 년 동안 암 치료에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 종양 세포에서 PD-L1의 이질적인 발현으로 인해 PD-1/PD-L1 억제제에 반응하는 환자는 극히 일부에 불과합니다. 이러한 이질성은 일반적으로 사용되는 면역조직화학(IHC) 접근법으로 종양 세포를 정밀하게 검출하는 데 어려움을 초래합니다. 이러한 상황은 치료 효능을 향상시키기 위해 면역 관문 차단 요법의 혜택을 받을 환자를 계층화하는 더 나은 방법을 요구합니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용하면 비침습적 방식으로 전신 PD-L1 발현을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 따라서 PET 이미징을 통해 종양의 PD-L1 분포를 검출하기 위한 방사성 표지 추적자의 개발이 필요합니다.

L-펩타이드와 비교하여 덱스트로로터리(D)-펩타이드는 단백질 분해 저항성 및 현저하게 연장된 대사 반감기와 같은 특성을 가지고 있습니다. 이 연구는 종양이 있는 마우스에서 D-도데카펩티드 길항제(DPA)인 68Ga-표지 PD-L1 표적 D-펩타이드의 PET 이미징을 기반으로 PD-L1 발현을 검출하는 새로운 방법을 설계했습니다. 그 결과, [68Ga]DPA는 생체 내에서 PD-L1 과발현 종양에 특이적으로 결합할 수 있으며, 우수한 이미징 능력과 함께 유리한 안정성을 보였으며, 이는 [68Ga]DPA-PET가 종양의 PD-L1 상태 평가에 유망한 접근법임을 시사합니다.

서론

면역관문단백질의 발견은 종양치료의 돌파구였으며, 면역관문차단요법 개발의 큰 진전을 이끌었다1. 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 및 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)은 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 여러 항체를 가진 잠재적인 약물 표적입니다. PD-1은 CD4+, CD8+ T세포, 조절T세포 등 종양 침윤 면역세포에 의해 발현됩니다. PD-L1은 PD-1 리간드 중 하나로, 다양한 종양 세포 2,3에서 과발현됩니다. PD-1과 PD-L1의 상호작용은 PD-1을 비활성화시켜 항종양 면역반응을 억제한다4. 이러한 발견은 PD-L1의 억제가 면역 세포의 사멸 효과를 개선하고 종양 세포를 제거할 수 있음을 시사한다5. 현재 발색 면역조직화학(chromogenic immunohistochemistry, IHC)은 면역관문요법에 반응할 가능성이 가장 높은 환자를 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 접근법이다 6,7

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프로토콜

동물 실험 절차는 난징 의과 대학의 동물 윤리위원회 또는 국립 양자 과학 기술 연구소의 승인을 받았습니다. 생쥐 실험은 실험동물 관리 및 이용 위원회의 제도적 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 펩타이드 합성

  1. 100mg의 4-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지(적재 용량 0.37mmol/g)를 N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 1mL에 30분 동안 약한 N2 버블링 하에서 팽창시킵니다.
  2. NMP 1mL에 Fmoc 보호 아미노산(5.0 당량), HCTU(4.9당량) 및 DIPEA(10.0당량)로 구성된 신선한 스톡 버퍼를 준비하고 수지(100mg)에 첨가합니다. 커플링 반응이 1.5-2시간 동안 진행되도록 합니다.
  3. NMP에서 50%(vol/vol) 모르폴린으로 구성된 탈보호화 완충액을 준비합니다. 수지(100mg)를 각 세척 시 탈보호 완충액 1mL로 2 x 30분 세척하여 아민기에서 Fmoc기를 제거합니다. 레진을 디클로로메탄(DCM, 1mL)으로 1분 동안 세척하고 DCM을 제거한 후 NMP(1mL)로 다시 1분 동안 세척합니다. 다음으로 NMP를 제거하고 DCM으로 1분 동안 수지를 다시 세척합니다.
    알림: 모든 ....

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결과

[68Ga]DPA 방사성 표지 및 안정성
모델 펩타이드인 DPA는 효과적인 PD-L1 길항제입니다. DOTA-DPA는 순도 >95%, 수율 68%로 수득되었습니다. DOTA-DPA의 질량은 실험적으로 1,073.3([M+2H]2+)에서 관찰됩니다. 68분갈륨은 PET 이미징을 위한 펩타이드를 라벨링하는 데 적합한 방사성 핵종으로 간주되므로 이 연구를 위해 선택되었습니다. 68Ga(반감기: 68분)의 방사성 표지 DPA에 DOTA-PEG3-DPA를 합성하였다(도 1A). DOTA는 68Ga 방사선 표지를 위한 킬레이터로 사용되었습니다. DOTA와 DPA를 공간화하기 위해 PEG3를 링커로 사용했습니다. [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA(이하 본문에서는 [

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토론

이 방법에 설명된 중요한 단계에는 DPA에 대한 68Ga의 효율적인 라벨링과 종양에서 DPA의 약력학적 패턴과 완벽하게 일치해야 하는 PET 이미징에 적합한 시간 창을 선택하는 것이 포함됩니다.

IHC와 달리 PET 이미징은 비침습적 방식으로 전신 PD-L1 발현을 실시간으로 검출할 수 있어 이질적인 종양의 각 양성 영역을 시각화할 수 있습니다 6,7. 펩타이드는 항체와 소분자의 단점을 피하기 위해 리간드로 선택되었습니다. 분자량이 큰 항체는 일반적으로 순환 반감기가 길기 때문에 건강한 장기에 더 높은 독성을 유발합니다. 작은 분자의 제거는 일반적으로 필요한 종양 보유를 달성하기에는 너무 빠릅니다. 펩타이드의 분자량은 항체와 소분자 사이의 분자량 범위입니다. 이를 통해 펩타이드 기반 방사성 추적자는 최소한의 독성으로 장기 종양 유지와 우수한 조직 침투를 모.......

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공개 사항

상충되는 이해관계는 선언되지 않습니다.

감사의 글

이 연구는 중국의학원 비영리중앙연구소 기금(제2022-RC350-04호)과 CAMS 의학혁신기금(제2021-I2M-1-026호, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101호, 2022-I2M-2-002호)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)Merck60239-18-168Ga  킬레이트화
3,3-디아미노벤지딘(DAB) 키트시그마-알드리치D7304-1SET면역조직화학
항-PD-L1 단클론 항체Wuhan Proteintech17952-1-AP면역조직화학: 1차 항체
BMS202Selleck1675203-84-5경쟁 결합 분석: 억제제
BSAMerckV900933면역형광 : 차단 
DAPIMerckD9542면역형광성: 디
클로로메탄핵 염색(DCM)Merck34856용매
DIPEAMerck3439펩타이드 커플링
EDC· HClMerckE6383DOTA
FBSGibco10099세포 배양의 활성화: 보충
FITC-conjugated anti-human IgG Fc 항체Biolegend409310면역형광: 2차 항체
FITC-conjugated anti PD-L1 항체Biolegend393606유세포 분석: 직접 항체
HCTUEnergy ChemicalE070004-25g펩타이드 커플링
HRP 표지 염소 항토끼 항체서비스바이오GB23303면역조직화학: 2차 항체
하이드록시숙신이미드(NHS)머크130672DOTA
MeCN머크PHR1551용매
모르폴린활성화 머크8.06127Fmoc- 탈보호
NMP머크8.06072Solevent
파라포름알데히드Merck30525-89-4조직 고정
PBSGibco10010023세포 배양: 완충액
페니실린-스트렙토마이신 Gibco10378016세포 배양:
RIA 튜브보충 PolyLabP10301A조직 샘플 용기
RPMI-1640 배지Gibco11875093세포 배양: 염기성 배지
아세트산 나트륨Merck1.06264완충액용 염
트립신-EDTAGibco25200056세포 배양: 해리제
U87MG 세포주프로셀 생명과학 & Technology CoCL-0238셀 모델
Equipment
68Ge/68Ga 발전기동위원소 기술 뮌헨, ITM적용되지 않음[68Ga]
Autogamma counter세대 Perkin Elmer Wizard2방사능 감지
Confocal 형광 현미경 Keyence면역형광 결과 관찰
유세포 분석기Becton, Dickinson, BDLSRIIPD-L1 양성 세포 모니터링
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)SHIMAZULC-20AT DPA 펩타이드의 정제
PET 스캐너Siemens Medical SolutionsInveon Multimodality SystemPET 이미징
광학 현미경 Nikon Eclipse E100면역 조직 화학 결과 관찰
고체상 펩타이드 합성기Promega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101DPA-DOTA 펩타이드 합성
Software
ASIProSiemens Medical Solutions해당 없음PET-CT 결과 분석
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1유세포 분석기 결과 분석
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical Solutions해당 없음PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0데이터 분석

참고문헌

  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis.

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태그

68 PETDPD L1PET

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