방법 논문

세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비

DOI:

10.3791/65069

⸱

2023년 3월 3일

 ,  ,  , 
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

이 논문에서

요약

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이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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세포외 기질(ECM)은 세포에 대한 구조적 지지를 제공하고 다양한 세포 과정에 중요한 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 2차원(2D) 세포 배양 모델은 완전한 3차원(3D) 지지체가 부족하여 세포 거동을 변화시켜 생체 내 공정을 이해하기에 부적절할 수 있기 때문에 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 지나치게 단순화합니다. ECM 구성 및 세포-ECM 상호 작용의 결핍은 다양한 질병의 중요한 원인입니다.

한 가지 예는 LAMA2-선천성 근이영양증(LAMA2-CMD)이며, 여기서 기능성 라미닌 211 및 221의 부재 또는 감소는 출생 시 또는 출생 직후에 감지할 수 있는 심각한 저조를 유발할 수 있습니다. 이 질환의 마우스 모델을 사용한 이전 연구는 태아 근 발생 중에 발병이 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구는 천연 미세 환경을 모방하여 근육 세포와 태아 근육 ECM 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 3D 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 E18.5 마우스 태아에서 해부된 등 깊은 근육을 사용하여 저삼투압 완충액, 음이온성 세제 및 DNase로 처리합니다. 그 결과 탈세포화 매트릭스(dECM)는 천연 조직과 비교하여 테스트된 모든 ECM 단백질(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)을 유지했습니다.

C2C12 근모세포가 이러한 dECM 위에 시드되었을 때, 그들은 dECM에 침투하여 식민지화하여 증식과 분화를 지원했습니다. 또한, C2C12 세포는 ECM 단백질을 생산하여 dECM 내에서 틈새 시장의 리모델링에 기여했습니다. 이 시험관 내 플랫폼의 구축은 LAMA2-CMD의 발병과 관련된 과정을 밝히기 위한 새로운 유망한 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 사이의 통신 결함이 질병 진행에 기여하는 다른 골격근 질환에 적응할 가능성이 있습니다.

서론

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세포외 기질(ECM)은 조직의 주요 구성 요소로, 비세포 구성 요소를 나타냅니다. 이 3차원(3D) 구조는 세포에 대한 물리적 지지를 제공할 뿐만 아니라 유기체1의 발달과 관련된 생화학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 조직 특이적 ECM의 형성은 다양한 세포 내 및 세포 외 자극의 영향을 받는 세포와 틈새 사이의 복잡한 상호 작용의 결과로 발달 중에 발생합니다. ECM은 시간적-공간적 방식으로 화학적, 기계적 재배열을 거쳐 세포 운명2에 직접적인 영향을 미치는 매우 역동적인 구조입니다. ECM의 가장 주목할만한 특징 중 하나는 기능적 다양성으로, 각 조직 ECM은 ECM이 포함하는 세포에 맞게 조정된 다양한 토폴로지와 특성을 제공하는 고유한 분자 조합을 표시하기 때문입니다1.

ECM 신호전달과 지원은 발달과 항상성에 매우 중요하며, 중단될 경우 여러 병리학적 상태를 유발할 수 있다 3,4. 한 가지 예는 선천성 근이영양증의 가장 흔한 형태인 LAMA2 결핍 선천성 이영양증(LAMA2-CMD)입니다. LAMA2 유....

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프로토콜

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설명된 모든 방법론은 리스본 대학교 과학부 동물 복지 위원회(ORBEA) 및 Direção Geral de Veterinária(DGAV; ref. 0421/000/000/2022)의 승인을 받았으며 유럽 지침 2010/63/EU를 따릅니다.

1. 탈세포화 완충액 및 시약의 제조

알림: 탈세포화 프로토콜 중에 사용되는 모든 용액은 고압증기멸균으로 멸균해야 하며 달리 명시되지 않는 한 최대 3개월 동안 보관해야 합니다.

  1. 탈염수(dH2O)에 137 mM의 염화나트륨(NaCl), 2.68 mM의 염화칼륨(KCl), 8.1 mM의 인산이수소칼륨(KH2PO4), 1.47 mM의디소듐-하이드로겐-포스페이트 이수화물(Na2HPO4)을 첨가하여 10x 인산완충식염수(10x PBS)를 준비하고 pH를 6.8로 조절한다. 100 mL의 10x PBS를 900 mL의 탈염된H2O에 첨가하여 1x PBS를 생성한다. 오토클레이브 및 실온(RT)에서 보관하십시오. 멸균 페니실린/스트렙토마이신 원액(10,000U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마....

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결과

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탈세포화 프로토콜의 목표는 천연 조직의 구성과 매우 유사한 dECM을 생산하는 것입니다. 탈세포화 과정의 효과를 결정하기 위해 조직 형태 검사, DNA 수준 측정, F-액틴 염색, 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅 기술을 사용한 주요 ECM 성분 분석 등 다양한 방법이 사용되었습니다. 구체적으로, 골격근 조직의 5가지 주요 ECM 성분을 분석하였다.

프로토콜 전반에 걸쳐 샘플의 모양이 바뀝니다(그림 1B 1-4). 분리 후 근육 조직은 미오글로빈의 존재로 인해 붉게 나타납니다(그림 1B1). 세포를 용해시키고 대부분의 세포 혈장 단백질을 제거하는 저삼투압 완충액에서 배양한 후 샘플은 흰색으로 변합니다(그림 1B

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토론

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ECM은 모든 조직에 존재하는 거대분자의 복잡한 네트워크로, 세포 거동과 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다2. ECM은 세포가 부착할 물리적 스캐폴드 역할을 하며 증식, 운동성, 분화 및 세포자멸사와 같은 세포 과정을 능동적으로 조절하는 신호를 제공합니다. 따라서 ECM의 적절한 형성과 유지는 발달과 항상성 모두에 필수적이다1.

2D 세포 배양 모델이 널리 사용되어 왔지만 점점 더 발전된 3D 플랫폼으로 대체되고 있습니다. 이는 2D 배양에는 세포 행동에 영향을 미치는 화학적, 물리적 단서가 부족한 반면, 3D 배양은 천연 조직에서 분자 및 세포 역학을 연구하기 위한 보다 현실적인 대안으로 간주되기 때문입니다11. 조직의 탈세포화는 다양한 조직 또는 기관 시스템에 걸친 다수의 연구에서 입증된 바와 같이 생물학적 조직의 미세 환경을 보다 밀접하게 모.......

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon, 계약 번호 23049), MATRIHEALTH 프로젝트 및 cE3c 단위 자금 지원 UIDB/00329/2020의 자금 지원을 받았습니다. MATRIHEALTH 프로젝트를 지원하기로 선택한 기부자 Henrique Meirelles에게 감사드립니다. 이 작업은 포르투갈 바이오이미징 플랫폼(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 참조)의 노드인 과학부 현미경 시설의 인프라를 활용했으며, 이미지 획득 및 처리에 도움을 준 Luís Marques에게 감사드립니다. 마지막으로, 기술 지원에 대해 Marta Palma와 관대 한 기여에 대해 연구팀에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12 웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균복부 LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔Bio-Rad4561093
48웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균복부 실험실P21023
96웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균복부 실험실P21024
소 혈청 알부민, 분획 VNZYtechMB04601
BX60 형광 현미경Olympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM 고포도당 w/ 안정 글루타민 w/ 피루브산 나트륨BiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & 조직 키트 Qiagen69506
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Merck108418
소 태아 혈청BiowestS1560-500
미세 팁 전사 피펫ThermoFisher15387823
염소 혈청BiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 인큐베이터Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α- 마우스IgG abcamab205719
ImageJ v. 1.53t
메틸 그린Sigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 분광 광도계 ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., 메탄올 프리Alfa Aesar043368-9M
페니실린-스트렙토마이신(100x) GRiSPGTC05.0100
팔로이딘 Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
폴리스티렌 페트리 접시 60x15mm 통풍구 (멸균)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS 키트Thermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 형광계Invitrogen15387293
S6E 줌 실체 현미경Leica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
슈퍼프로스트® 플러스 접착 슬라이드Thermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기판Thermo Scientific15626144
TCS, SPE 컨포칼 현미경Leica
Tris-(hidroximetil), aminometano (Tris base) ≥ 99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL 멤브레인 롤 (0.22µ m)AdvanstaL-08024-001
α - 콜라겐 Iabcamab21286
α - 콜라겐 IVMilliporeAB756P
α - 콜라겐 IV산타 크루즈 생명 공학sc-398655
α - Fibronectin시그마F-3648
α - 라미닌 α 2 시그마L-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-마우스 Alexa 488분자 프로브A11017
α-마우스 Alexa 568분자 프로브A11019
α-pan-LamininSigmaL-9393
α-phospho-histone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568분자 프로브A21069
α-Rabbit Alexa 488분자 프로브A11070
α-Rat Alexa 488분자 프로브A11006
: , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F.

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재인쇄 및 허가

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태그

ECMC2C122IDNase

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