이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포외 기질(ECM)은 세포에 대한 구조적 지지를 제공하고 다양한 세포 과정에 중요한 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 2차원(2D) 세포 배양 모델은 완전한 3차원(3D) 지지체가 부족하여 세포 거동을 변화시켜 생체 내 공정을 이해하기에 부적절할 수 있기 때문에 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 지나치게 단순화합니다. ECM 구성 및 세포-ECM 상호 작용의 결핍은 다양한 질병의 중요한 원인입니다.
한 가지 예는 LAMA2-선천성 근이영양증(LAMA2-CMD)이며, 여기서 기능성 라미닌 211 및 221의 부재 또는 감소는 출생 시 또는 출생 직후에 감지할 수 있는 심각한 저조를 유발할 수 있습니다. 이 질환의 마우스 모델을 사용한 이전 연구는 태아 근 발생 중에 발병이 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구는 천연 미세 환경을 모방하여 근육 세포와 태아 근육 ECM 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 3D 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 E18.5 마우스 태아에서 해부된 등 깊은 근육을 사용하여 저삼투압 완충액, 음이온성 세제 및 DNase로 처리합니다. 그 결과 탈세포화 매트릭스(dECM)는 천연 조직과 비교하여 테스트된 모든 ECM 단백질(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)을 유지했습니다.
C2C12 근모세포가 이러한 dECM 위에 시드되었을 때, 그들은 dECM에 침투하여 식민지화하여 증식과 분화를 지원했습니다. 또한, C2C12 세포는 ECM 단백질을 생산하여 dECM 내에서 틈새 시장의 리모델링에 기여했습니다. 이 시험관 내 플랫폼의 구축은 LAMA2-CMD의 발병과 관련된 과정을 밝히기 위한 새로운 유망한 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 사이의 통신 결함이 질병 진행에 기여하는 다른 골격근 질환에 적응할 가능성이 있습니다.
서론
세포외 기질(ECM)은 조직의 주요 구성 요소로, 비세포 구성 요소를 나타냅니다. 이 3차원(3D) 구조는 세포에 대한 물리적 지지를 제공할 뿐만 아니라 유기체1의 발달과 관련된 생화학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 조직 특이적 ECM의 형성은 다양한 세포 내 및 세포 외 자극의 영향을 받는 세포와 틈새 사이의 복잡한 상호 작용의 결과로 발달 중에 발생합니다. ECM은 시간적-공간적 방식으로 화학적, 기계적 재배열을 거쳐 세포 운명2에 직접적인 영향을 미치는 매우 역동적인 구조입니다. ECM의 가장 주목할만한 특징 중 하나는 기능적 다양성으로, 각 조직 ECM은 ECM이 포함하는 세포에 맞게 조정된 다양한 토폴로지와 특성을 제공하는 고유한 분자 조합을 표시하기 때문입니다1.
ECM 신호전달과 지원은 발달과 항상성에 매우 중요하며, 중단될 경우 여러 병리학적 상태를 유발할 수 있다 3,4. 한 가지 예는 선천성 근이영양증의 가장 흔한 형태인 LAMA2 결핍 선천성 이영양증(LAMA2-CMD)입니다. LAMA2 유....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
설명된 모든 방법론은 리스본 대학교 과학부 동물 복지 위원회(ORBEA) 및 Direção Geral de Veterinária(DGAV; ref. 0421/000/000/2022)의 승인을 받았으며 유럽 지침 2010/63/EU를 따릅니다.
1. 탈세포화 완충액 및 시약의 제조
알림: 탈세포화 프로토콜 중에 사용되는 모든 용액은 고압증기멸균으로 멸균해야 하며 달리 명시되지 않는 한 최대 3개월 동안 보관해야 합니다.
- 탈염수(dH2O)에 137 mM의 염화나트륨(NaCl), 2.68 mM의 염화칼륨(KCl), 8.1 mM의 인산이수소칼륨(KH2PO4), 1.47 mM의디소듐-하이드로겐-포스페이트 이수화물(Na2HPO4)을 첨가하여 10x 인산완충식염수(10x PBS)를 준비하고 pH를 6.8로 조절한다. 100 mL의 10x PBS를 900 mL의 탈염된H2O에 첨가하여 1x PBS를 생성한다. 오토클레이브 및 실온(RT)에서 보관하십시오. 멸균 페니실린/스트렙토마이신 원액(10,000U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
탈세포화 프로토콜의 목표는 천연 조직의 구성과 매우 유사한 dECM을 생산하는 것입니다. 탈세포화 과정의 효과를 결정하기 위해 조직 형태 검사, DNA 수준 측정, F-액틴 염색, 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅 기술을 사용한 주요 ECM 성분 분석 등 다양한 방법이 사용되었습니다. 구체적으로, 골격근 조직의 5가지 주요 ECM 성분을 분석하였다.
프로토콜 전반에 걸쳐 샘플의 모양이 바뀝니다(그림 1B 1-4). 분리 후 근육 조직은 미오글로빈의 존재로 인해 붉게 나타납니다(그림 1B1). 세포를 용해시키고 대부분의 세포 혈장 단백질을 제거하는 저삼투압 완충액에서 배양한 후 샘플은 흰색으로 변합니다(그림 1B
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
ECM은 모든 조직에 존재하는 거대분자의 복잡한 네트워크로, 세포 거동과 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다2. ECM은 세포가 부착할 물리적 스캐폴드 역할을 하며 증식, 운동성, 분화 및 세포자멸사와 같은 세포 과정을 능동적으로 조절하는 신호를 제공합니다. 따라서 ECM의 적절한 형성과 유지는 발달과 항상성 모두에 필수적이다1.
2D 세포 배양 모델이 널리 사용되어 왔지만 점점 더 발전된 3D 플랫폼으로 대체되고 있습니다. 이는 2D 배양에는 세포 행동에 영향을 미치는 화학적, 물리적 단서가 부족한 반면, 3D 배양은 천연 조직에서 분자 및 세포 역학을 연구하기 위한 보다 현실적인 대안으로 간주되기 때문입니다11. 조직의 탈세포화는 다양한 조직 또는 기관 시스템에 걸친 다수의 연구에서 입증된 바와 같이 생물학적 조직의 미세 환경을 보다 밀접하게 모.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon, 계약 번호 23049), MATRIHEALTH 프로젝트 및 cE3c 단위 자금 지원 UIDB/00329/2020의 자금 지원을 받았습니다. MATRIHEALTH 프로젝트를 지원하기로 선택한 기부자 Henrique Meirelles에게 감사드립니다. 이 작업은 포르투갈 바이오이미징 플랫폼(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 참조)의 노드인 과학부 현미경 시설의 인프라를 활용했으며, 이미지 획득 및 처리에 도움을 준 Luís Marques에게 감사드립니다. 마지막으로, 기술 지원에 대해 Marta Palma와 관대 한 기여에 대해 연구팀에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12 웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균 | 복부 Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4– 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔 | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균 | 복부 실험실 | P21023 | |
| 96웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균 | 복부 실험실 | P21024 | |
| 소 혈청 알부민, 분획 V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 형광 현미경 | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM 고포도당 w/ 안정 글루타민 w/ 피루브산 나트륨 | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & 조직 키트 | Qiagen | 69506 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | Merck | 108418 | |
| 소 태아 혈청 | Biowest | S1560-500 | |
| 미세 팁 전사 피펫 | ThermoFisher | 15387823 | |
| 염소 혈청 | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α- 마우스 | IgG abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| 메틸 그린 | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 분광 광도계 | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., 메탄올 프리 | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| 페니실린-스트렙토마이신(100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| 팔로이딘 Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| 폴리스티렌 페트리 접시 60x15mm 통풍구 (멸균) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS 키트 | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 형광계 | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E 줌 실체 현미경 | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| 슈퍼프로스트® 플러스 접착 슬라이드 | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기판 | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS, SPE 컨포칼 현미경 | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil), aminometano (Tris base) ≥ 99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL 멤브레인 롤 (0.22µ m) | Advansta | L-08024-001 | |
| α - 콜라겐 I | abcam | ab21286 | |
| α - 콜라겐 IV | Millipore | AB756P | |
| α - 콜라겐 IV | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-398655 | |
| α - Fibronectin | 시그마 | F-3648 | |
| α - 라미닌 α 2 | 시그마 | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-마우스 Alexa 488 | 분자 프로브 | A11017 | |
| α-마우스 Alexa 568 | 분자 프로브 | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L-9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | 분자 프로브 | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | 분자 프로브 | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | 분자 프로브 | A11006 |
참고문헌
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
