Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

고지혈증은 인체 건강에 심각한 영향을 미치는 흔한 대사 질환이며 심혈관 질환의 주요 위험 요소이기도 합니다¹. 최근에는 이 질병에 대한 연령 관련 감소 추세가 있으며, 장기간의 불규칙한 생활 방식과 건강에 해로운 식습관으로 인해 젊은 사람들이 더 취약해지고 있습니다². 본 클리닉에서는 고지혈증을 치료하기 위해 다양한 약물이 사용되고 있습니다. 예를 들어, 고지혈증 및 관련 죽상경화성 질환 환자에게 가장 일반적으로 사용되는 약물 중 하나는 스타틴입니다. 그러나 스타틴을 장기간 사용하면 무시할 수 없는 부작용이 있어 과민증, 치료 내성, 부작용 등 예후가 좋지 않습니다^3,4. 이러한 단점은 고지혈증 환자에게 추가적인 고통이 되었습니다. 따라서 안정적인 지질 저하 효능과 부작용 감소를 위한 새로운 치료법이 제안되어야 합니다.

Traditional Chinese Medicine (TCM)은 효능이 좋고 부작용이 적기 때문에 질병 치료에 널리 사용되었습니다 ⁵. Fructus Phyllanthi (FP), Phyllanthus emblica Linn의 말린 과일. (일반적으로 amla 베리 또는 인도 구스베리로 알려진)는 전통 중국어 및 인도 의약품의 유명한 의학 및 식품 상동 물질입니다 ^6,7. 이 약은 TCM 이론에 따라 열을 정화하고, 혈액을 냉각시키고, 소화를 촉진하는 데 사용되었습니다⁸. 현대 약리학 연구에 따르면 FP는 갈산, 엘라그산 및 케르세틴^{9와 같은 생체 활성 화합물이 풍부}하며, 이는 항산화제, 항염증제, 간 보호제, 항저지방혈증 등의 역할을 하여 다양한 다면적 생물학적 특성을 담당합니다¹⁰. 최근 연구에서는 FP가 고지혈증 환자의 혈중 지질을 효과적으로 조절할 수 있다는 사실도 밝혀졌습니다. 예를 들어, Variya et al.¹¹은 FP 과일 주스와 주요 화학 성분인 갈산이 혈장 콜레스테롤을 감소시키고 간과 대동맥의 기름 침투를 줄일 수 있음을 입증했습니다. 치료 효능은 과산화소체 증식제 활성화 수용체-알파의 발현을 증가시키고 간 지방생성 활성을 감소시키는 FP의 조절과 관련이 있었습니다. 그러나 고지혈증을 개선하는 FP의 기본 메커니즘은 생체 활성 성분이 매우 광범위하기 때문에 추가 연구가 필요합니다. 우리는 FP의 치료 효능의 잠재적 메커니즘을 탐구하고자 했으며, 이는 이 약물의 추가 개발 및 활용에 도움이 될 수 있습니다.

현재 네트워크 약리학은 한의학의 치료 메커니즘을 연구하기 위한 전체론적이고 효율적인 기술로 간주됩니다. 개별 표적만을 치료하는 단일 질병 유발 유전자 및 약물을 찾는 대신, 완전한 약물-성분-유전자-질병 네트워크를 구축하여 포괄적인 치료와 관련하여 다중 성분 약물의 다중 표적 메커니즘을 찾습니다¹². 이 기술은 화학 성분이 방대하기 때문에 TCM에 특히 적합합니다. 불행히도 네트워크 약리학은 이론적으로 화학 성분의 영향을 받는 표적을 예측하는 데만 사용할 수 있습니다. 네트워크 약리학의 효과를 검증하기 위해 질병 모델의 내인성 대사 산물을 관찰해야 합니다. 시스템 생물학의 발전과 함께 등장한 대사체학 방법은 내인성 대사 산물의 변화를 모니터링하기 위한 중요한 도구입니다¹³. 대사 산물의 변화는 숙주의 정상 상태 변화를 반영하며, 이는 내부 메커니즘을 연구하기 위한 중요한 지표이기도 합니다. 일부 연구자들은 약물과 질병 간의 상호 작용 메커니즘을 탐구하기 위해 네트워크 약리학과 대사체학을 성공적으로 통합했습니다^14,15.

이 기사는 네트워크 약리학과 대사체학 기술을 통합하여 고지혈증에 대한 FP의 기계론적 기초를 탐구합니다. FP의 주요 활성 성분과 고지혈증의 분자 표적 사이의 관계를 분석하기 위해 네트워크 약리학을 적용했습니다. 그 후, 동물모델에서 내인성 대사산물의 변화를 관찰하기 위해 대사체학을 시행하였으며, 이는 대사 수준에서의 약물 작용을 설명할 수 있습니다. 네트워크 약리학 또는 대사체학만 적용하는 것과 비교했을 때, 이 통합 분석은 보다 구체적이고 포괄적인 연구 메커니즘을 제공했습니다. 또한 분자 도킹 전략을 사용하여 활성 성분과 주요 단백질 간의 상호 작용을 분석했습니다. 일반적으로 이러한 통합적 접근법은 네트워크 약리학에 대한 실험적 근거가 부족하고 대사체학 방법에 대한 내인성 기전이 부족한 점을 보완할 수 있으며, 자연의학의 치료 기전 분석에 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 주요 회로도 그림 1.

동물 취급과 관련된 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 청두 중국 의학 대학의 가이드에 따라 수행되었으며 성두 중국 전통 의학 대학의 기관 윤리 위원회(프로토콜 번호 2020-36)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 수컷 C57BL/6 마우스(20 ± 2g)를 사용했습니다. 마우스는 상업적 출처에서 얻었다(재료 표 참조).

1. 네트워크 약리학 기반 예측

참고: 네트워크 약리학은 고지혈증에 대한 FP의 활성 성분과 주요 표적을 예측하는 데 사용됩니다.

1. 활성 성분 및 핵심 표적 선택
   1. Traditional Chinese Medicine 시스템의 약리학 데이터베이스(TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) FP.
      의 후보 활성 성분 및 표적 목록을 얻습니다. 참고: 일반적으로 데이터베이스에서 경구 생체 이용률(OB)이 ≥30%이고 약물 유사(DL) 값이 ≥0.18인 성분만 활성 성분으로 포함됩니다.
   2. GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/), Online Mendelian Inheritance in Man 데이터베이스(OMIM; https://omim.org/) 및 치료 표적 데이터베이스(TTD; http://db.idrblab.net/ttd/)에서 키워드 "고지혈증"을 검색하여 고지혈증의 각 후보 표적을 얻습니다. 질병 표적의 스프레드시트를 다운로드하십시오. 반복되는 표적을 삭제하여 고지혈증 표적 목록을 얻습니다.
   3. 1.1.1 및 1.1.2 단계의 목록을 새 스프레드시트에 복사합니다. 도구 모음의 "Data - Identify Duplicates" 기능을 사용하여 교차 대상을 가져옵니다. 유전자 및 단백질 이름을 표준화하기 위해 교차 표적 목록을 UniProtKB(http://www.uniprot.org/)로 가져옵니다.
      참고: 이러한 표적은 FP 및 고지혈증과 관련이 있습니다. 따라서 이러한 교차 표적을 고지혈증에 대한 FP의 목표로 예측합니다.
2. 단백질-단백질 상호작용 네트워크의 구축
   1. STRING 데이터베이스(https://string-db.org/) 11.5를 엽니다. 고지혈증에 대한 FP의 교차 대상 목록을 "List of Names" 대화 상자에 붙여넣습니다. "Organisms"에서 Homo sapiens를 선택하고 SEARCH > CONTINUE.
      를 클릭하십시오. 참고: 인간과 생쥐는 매우 유사한 유전자를 가지고 있습니다. 따라서 마우스로 추가 실험적 검증이 수행됩니다.
   2. 결과를 사용할 수 있게 되면 "고급 설정"에서 네트워크에서 연결이 끊긴 노드 숨기기를 선택합니다. "최소 필수 상호 작용 점수"에서 가장 높은 신뢰도(0.900)를 설정한 다음 UPDATE 버튼을 클릭합니다.
   3. 제목 표시줄에서 내보내기를 클릭하고 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크의 짧은 표 텍스트를 PNG 및 TSV 형식으로 다운로드합니다.
3. 의약품-성분-질병-표적 네트워크 구축
   1. Cytoscape 3.9.1을 엽니다(재료 표 참조). 1.2.3단계의 TSV 형식 파일을 가져옵니다. 네트워크 노드의 색상, 글꼴 및 측면을 제어판의 스타일 표시줄을 통해 최적화합니다.
   2. 네트워크 토폴로지 분석을 위해 "네트워크 분석" 기능을 사용합니다. Cytoscape에서 CytoHubba에 의해 허브 유전자를 얻습니다. 의약품-성분-표적-질환 네트워크를 구축합니다.
4. GO 및 KEGG 농축 분석
   1. DAVID 생물정보학 리소스(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)를 엽니다. Start Analysis(분석 시작)를 클릭하고 대상 목록을 왼쪽 대화 상자에 붙여넣습니다. "SELECT IDENTIFIER"에서 OFFICIAL GENE SYMBOL을 선택합니다. "종 선택"에서 호모 사피엔스를 선택합니다. "목록 유형"에서 유전자 목록을 선택합니다. Submit List(목록 제출)를 클릭합니다.
   2. 결과를 사용할 수 있게 되면 DAVID 도구 중 하나를 사용하여 위의 유전자 목록 분석을 클릭합니다. GO 기능 강화 분석을 위한 "Gene Ontology"의 GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT 표시합니다. KEGG 경로 농축 분석을 위한 "Pathways"의 KEGG_Pathway 표시합니다.
   3. 기능 주석 차트를 클릭하여 결과를 표시합니다.
      참고: 농축 분석의 통계적 유의성 임계값을 p < 0.05로 설정합니다.

2. 실험적 설계

1. FP 수성 추출물 준비
   참고: FP는 Chengdu University of TCM^{8의 Lina Xia 교수 실험실에서 처리됩니다}.
   1. 깨끗한 2L 부피 플라스크에 1L의 순수한 물에 FP(90g)의 건조된 분말을 담그십시오. 초음파 처리(4°C 수조, 전력: 250W, 주파수: 35kHz)를 사용하여 30분 동안 용해시킵니다. 용액을 여과하여 이중층, 1mm x 1mm 멸균 의료용 거즈로 추출물을 얻습니다. FP의 완전한 용해를 보장하기 위해 위의 작업을 세 번 반복합니다.
   2. 추가 농축을 위해 회전 증발 방법을 사용하십시오. 회전 속도를 50시간 동안 60°C의 온도에서 4rpm으로 설정합니다. 수성 추출물을 100mL로 농축합니다.
   3. FP(0.9g/mL)의 미처리 추출물을 두 부분(50mL)으로 균등하게 나눕니다. 한 부분은 고용량 FP 액체(0.9g/mL)로 사용됩니다. 다른 부분에 순수한 물 50mL를 넣고 저용량 FP 액체(0.45g/mL)로 간주합니다. 투여를 위해 고용량 및 저선량 FP 수용액을 사용하십시오. 사용할 때까지 액체를 -20 °C에서 보관하십시오.
2. 동물 준비
   1. 50마리의 수컷 C57BL/6 마우스(20 ± 2g)를 환기가 잘 되는 실온에 보관하고 12시간 명암 주기와 음식과 순수한 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다.
   2. 쥐를 두 그룹에 무작위로 할당: 고지혈증을 유발하기 위해 정상 식단을 따르는 마우스 10마리와 고지방 식단을 따르는 마우스 40마리(재료 표 참조)를 먹이십시오.
      참고: 8주 동안 먹이를 준 후 쥐는 추가 약물 개입을 위해 선별 검사를 받았습니다.
   3. 8주째에는 각 마우스 안와에서 약 200μL의 혈액을 추출합니다. 혈장 샘플을 얻기 위해 4°C에서 5,733 x g에서 10분 동안 혈액을 원심분리합니다. 시판되는 분석 키트를 사용하여 TC 및 TG 수준을 측정합니다(재료 표 참조).
   4. 지질 수치가 가장 정상인 마우스 6개를 무처리 대조군(NC) 그룹으로 선택합니다. 지질 수치가 현저히 높은 24마리의 마우스를 고지방 다이어트 그룹으로 선택하고 고지방 다이어트(HFD) 그룹, 저용량 FP(FP_L) 그룹, 고용량 FP(FP_H) 그룹 및 양성 대조군(PC) 그룹의 4개 그룹으로 무작위로 나눕니다.
   5. FP_L 및 FP_H 그룹에는 FP의 두 가지 용량(저용량, 4.5 g/kg 및 고용량, 9 g/kg)으로 위 세척을 실시하고, 심바스타틴 정제(5 mg/kg; 재료 표 참조)를 사용한 PC 그룹에게는 위 세척을; 4주 동안 하루에 한 번 동일한 양의 생리식염수로 NC 및 HFD 그룹에게는 위 세척을 실시합니다.
      참고: 현재 연구에서는 치료를 위해 FP와 심바스타틴의 수용액을 사용했습니다.
   6. 12 주째에 1 % 펜토 바르비탈 나트륨 (30mg / kg)으로 마취 한 후 모든 그룹의 마우스를 희생합니다. 각 마우스의 안와 정맥에서 ~400μL의 혈액 샘플을 수집합니다.
      알림: 핀셋으로 마우스의 발가락과 발바닥을 자극합니다. 반응이 없으면 적절한 마취가 이루어졌다는 증거입니다.
   7. 4°C에서 5,733 x g로 10분 동안 혈액을 원심분리하여 혈장 샘플을 얻고 시중에서 판매되는 분석 키트를 사용하여 TC, TG, LDL-C 및 HDL-C 수준을 측정합니다(재료 표 참조). 간 조직 샘플을 얻고¹⁶ 조직병리학적 분석을 실시합니다. 대사체학 분석을 위해 나머지 혈장 및 간 검체를 사용합니다(3단계).
      참고: 모든 샘플은 사용할 때까지 -80°C에서 보관됩니다.
3. 간 조직병리학적 검사
   1. 4% 파라포름알데히드 용액으로 신선한 간 조직을 24시간 이상 고정합니다. 고정제에서 조직을 꺼내고 메스로 대상 조직을 매끄럽게 합니다. 조직과 해당 라벨을 탈수기에 넣습니다.
   2. 에탄올 그라디언트에서 탈수: 75% 알코올(4시간), 85% 알코올(2시간), 90% 알코올(2시간), 95% 알코올(1시간), 앱솔루트 에탄올(1시간), 크실렌(30분)조직 카세트를 파라핀 왁스에 묻힌 조직 틀에 넣고 각각 30분씩 3회 세척합니다¹⁶.
   3. 왁스에 적신 조직을 조직 포진기에 넣습니다(재료 표 참조). 왁스가 응고되기 전에 탈수기에서 조직을 제거하고 내장된 상자에 넣고 해당 라벨을 부착합니다.
   4. -20°C의 동결 테이블에서 왁스 블록을 식히고 내장된 프레임에서 왁스 블록을 제거한 다음 왁스 블록을 다듬습니다.
   5. 마이크로톰을 사용하여 트리밍된 왁스 블록을 3μm 두께의 절편으로 자릅니다(재료 표 참조). 섹션을 40°C의 물에 띄우고 슬라이드에서 제거한 다음 60°C 오븐에서 굽습니다. 물과 마른 왁스로 구운 후에는 꺼내서 실온에 보관하십시오.
   6. 크실렌 I을 10분, 크실렌 II를 10분, 크실렌 III을 10분, 앱솔루트 에탄올 I을 5분, 앱솔루트 에탄올 II를 5분, 75% 알코올을 5분, 물로 세척합니다¹⁶.
   7. 헤마톡실린 염색 용액으로 4분, 분화를 위해 1% 염산 알코올 용액(75% 알코올), 1% 암모니아 수용액으로 다시 파란색으로 단면을 염색하고 물로 씻습니다.
   8. 에오신 염색 용액으로 부분을 2분 동안 염색하고 물로 씻습니다.
   9. 200x 및 400x 배율의 광학 현미경을 사용하여 단면을 관찰합니다.
4. 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법)LC-MS) 분석
   1. FP
      의 성분 식별 참고: 분석은 하이브리드 사중극자-오비트랩 고분해능 질량분석법(UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS, 재료 표 참조)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행됩니다.
      1. FP의 건조 분말 1g을 정확하게 측정하여 깨끗한 50mL 부피 플라스크에 넣습니다.
      2. 70% 메탄올 25mL를 부피 플라스크에 넣고 정확하게 칭량합니다. 초음파 처리(4°C 수조, 전력: 250W, 주파수: 35kHz)를 30분 동안 사용하여 용해를 돕습니다. 용해 후 손실을 정확하게 결정하기 위해 다시 정확하게 계량하고 70% 메탄올을 사용하여 손실을 보충합니다.
         알림: 부피 측정 플라스크의 스케일이 정확하지 않으므로, 특히 4°C 수조 후에는 부피를 측정하지 마십시오.
      3. 잘 섞이도록 흔듭니다. 0.22μm 미세 다공성 멤브레인을 사용하여 필터링합니다.
   2. 플라즈마 시료 준비
      1. 1.5mL 원심분리 튜브의 두 배 부피(200μL)의 아세토니트릴에 100μL의 혈장(단계 2.2.7)을 정밀하게 첨가하고 최소 30초 동안 와류 진동기로 와류를 회전시킵니다. 모든 샘플에 대해 이 절차를 따릅니다.
      2. 모든 샘플을 17,200 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상등액을 새 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상등액을 질소로 건조시킵니다. 200μL의 추출 용매(아세토니트릴:물 = 4:1 [v/v])로 재구성합니다.
      3. 재구성된 용액을 최소 30초 동안 소용돌이치고 10분 동안 초음파 처리를 사용합니다(4°C 수조, 전력: 250W, 주파수: 35kHz). 17,200 x g에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
      4. 0.22μm 필터 멤브레인으로 상층액을 여과하고 분석을 위해 4°C로 유지합니다.
   3. 간 시료 전처리
      1. 얼음처럼 차가운 메탄올 물(1:1, v/v, 1mL)에서 1분 동안 간 조직 90mg을 균질화하고(단계 2.2.7) 4°C에서 10분 동안 21,500 x g에서 원심분리합니다.상등액을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 모든 샘플에 대해 이 절차를 따릅니다.
      2. 동일한 절차에 따라 침전물을 다시 추출하고 상등액을 새로운 1.5mL 원심분리 튜브에 함께 모읍니다. 상등액을 질소로 건조시킵니다. 300μL의 추출 용매(메탄올:물 = 4:1 [v/v])로 재구성합니다.
      3. 재구성된 용액을 최소 30초 동안 소용돌이치고 10분 동안 초음파 처리를 사용합니다(4°C 수조, 전력: 250W, 주파수: 35kHz). 17,200 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기.
      4. 0.22μm 필터 멤브레인으로 상층액을 여과하고 분석을 위해 4°C로 유지합니다.
         참고: 통합 품질 관리(QC) 샘플은 각 혈장 및 간 샘플에서 10μL 분취량(샘플 6개당 1개)을 혼합하여 준비되었습니다.
   4. LC-MS
      의 분석 매개변수 참고: 이동상은 0.1% 포름산(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B)로 구성됩니다. 이러한 용매를 깨끗한 유리병에 옮기고 LC-MS 시스템에 연결합니다.
      1. LC-MS 시스템의 "주입구 파일"에서 혈장 샘플의 그래디언트 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 1% B(0-1.5분), 1%-60% B(1.5-13.0분), 60%-99% B(13.0-20.0분), 99% B(20.0-25.0분), 99%-1% B(25.0-25.1분)로 유지, 27분까지 1% B를 유지합니다.
      2. LC-MS 시스템의 "주입구 파일"에서 플라즈마 샘플의 자동 시료 주입 조건을 다음과 같이 설정합니다: 주입 부피, 2μL, 각 분석에 대한 유속(0.3mL/분).
      3. LC-MS 시스템의 "주입구 파일"에서 간 샘플의 그래디언트 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 1% B(0-1분), 1%-53% B(1-15분), 53%-70% B(15-30분), 70%-90% B(30-32분), 90%-95% B(32-40분), 95%-1% B(40-42분) 및 45분까지 1% B를 유지합니다.
      4. LC-MS 시스템의 "주입구 파일"에서 간 샘플의 자동 시료 주입 조건을 다음과 같이 설정합니다: 주입량, 5μL, 각 분석에 대한 유속, 0.3mL/분.
      5. LC-MS 시스템의 "MS tune file"에서 혈장 및 간 샘플의 MS 검출 조건을 설정합니다. 포지티브 및 네거티브 이온화 모드를 모두 사용하여 MS 수집을 수행합니다.
         참고: 가열된 전기 분무 이온화 매개변수는 다음과 같습니다: 스프레이 전압: 양이온화의 경우 3.5kV 및 음이온 화의 경우 3.8kV; 칼집 가스 흐름: 55 arb; 보조 가스 유량 : 15 arb; 프로브 히터 온도: 300 °C; 그리고 모세관 온도: 350 °C.
      6. 수집된 원시 데이터를 Compound Discoverer 소프트웨어로 가져오고 제조업체의 지침에 따라 분석법 템플릿을 설정합니다(재료 표 참조).

3. 대사체 검증

참고: 혈장 및 간 대사 산물의 대사체 프로파일링 데이터를 Compound Discoverer 소프트웨어로 가져와 분자 특징 추출 알고리즘을 채택하여 대사 특징 추출을 수행합니다. 매개변수를 다음과 같이 설정하십시오: 질량 편차, 5 x 10-6; 질량 범위, 100-1,500; 신호 대 잡음비(SNR) 임계값, 3; 및 머무름 시간 편차, 0.05. QC 피크 영역의 상대 표준 편차(RSD)로 대사체학의 안정성과 반복성을 평가합니다.

1. SIMCA-P 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 LC-MS 결과에서 얻은 적분 값의 다변량 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 평균 중심 데이터 및 표본 클래스의 모델링을 위해 OPLS-DA(Orthogonal Partial Least Squares discriminant analysis)를 사용합니다.
2. OPLS-DA 테스트 후 투영(VIP) 값 >1의 가변 중요도와 적분과 스튜던트 t-테스트의 p-값 <0.05를 전위 차등 대사 산물로 고려합니다.
3. Human Metabolome(HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG; https://www.kegg.jp/) 및 MetaboAnalyst5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)을 포함한 개방형 데이터베이스 소스를 통해 교란된 대사 산물 및 대사 경로를 식별합니다.
4. MetaboAnalyst5.0 및 'Wu Kong' 플랫폼(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)으로 결과 보기를 시각화합니다.

4. 분자 도킹

1. TCMSP 데이터베이스에서 선택한 FP 성분의 3D 구조를 각각 다운로드합니다. 'Chemical name' 검색창에서 성분명을 검색하고 해당 3D 구조 파일을 mol2 형식으로 다운로드합니다.
2. AlphaFold Protein Structure Database(Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/)에서 주요 표적의 결정 구조를 다운로드합니다. 검색 상자에서 대상 이름을 검색하고 해당 결정 구조 파일을 pdb 형식으로 다운로드합니다.
3. 재료 및 대상 구조 파일을 AutoDockTools 소프트웨어로 가져올 수 있습니다. 물 분자를 삭제하려면 Edit > Delete Water를 클릭합니다. Edit > Hydrogens > Add를 클릭하여 수소를 추가합니다. 성분을 '리간드'로 설정하고 전체 타겟을 'receptor'^{17로 선택하여 블라인드 도킹을 수행합니다}.
4. "center"와 "size" 뒤의 상자에 값을 입력하면 새로 개발된 공간을 조정하여 리간드와 수용체를 완전히 포괄할 수 있습니다. 리간드 파일과 수용체 파일을 pdbqt 형식으로 저장합니다.
5. AutoDock Vina를 사용하여 분자 도킹을 수행합니다. "Receptor" 바를 'receptor.pdbqt'의 이름으로 설정하고, "Ligand" 바를 'ligand.pdbqt'의 이름으로 설정합니다. 수용체에 대한 리간드 결합을 위한 최적의 위치를 얻습니다. 최적의 위치에서 결합 에너지 값을 기록합니다.
   참고: 도킹 프로세스는 Genetic Algorithm^{14에 의해 계산되었습니다}. 모든 도킹 실행 옵션은 기본값이었습니다. 도킹 프레임은 가장 높은 바인딩 에너지에서 가장 낮은 바인딩 에너지로 자동 순위가 매겨집니다.
6. 도킹 파일을 PILP(Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)로 가져와서 시각 시스템 모델을 가져옵니다. 모델 파일을 pse 형식으로 다운로드하고 PyMOL 소프트웨어(재료 표 참조)로 가져와서 추가 시각화를 구성합니다.

5. 통계 분석

참고: 데이터 분석을 위해 SPSS 통계 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하십시오. p < 0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

1. 값을 표준 편차(SD)± 평균으로 표현합니다.
2. 일원 분산 분석을 수행한 후 LSD(Post Hoc Least Significant Difference), Dunnett(등분산의 경우) 또는 Dunnett의 T3(불균등 분산의 경우)를 수행하여 그룹 간의 통계적 유의성을 검정합니다.

네트워크 약리학
FP의 총 18가지 잠재적 성분을 데이터베이스 및 LC-MS 분석의 약동학 및 약력학 특성에 따라 스크리닝했습니다(총 이온 크로마토그램은 보충 그림 1에 나와 있음). 관련 문헌을 통해 갈산의 함량은 다른 성분보다 훨씬 높으며 지질을 낮추는 데 효과적입니다9,11. 따라서 이 성분도 잠재적인 성분으로 간주되었습니다. FP의 총 19개 성분과 134개 성분 관련 표적이 발견되었습니다. 19가지 성분이 모두 표 1에 나와 있습니다. 추가 분석을 위해 가장 대표적인 성분을 선택하기 위해 이러한 성분을 BATMAN-TCM, http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/ 중의학 분자 기계학을 위한 생물정보학 분석 도구(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine) 데이터베이스로 가져왔습니다. 성분-표적-경로-질병 네트워크에 따르면, 갈산, 케르세틴, 베타-시토스테롤과 같은 일부 생리 활성 성분이 고콜레스테롤혈증 및 관상동맥 죽상동맥경화증과 관련된 FP의 가장 중요한 성분으로 확인되었습니다(보충 그림 2). 이 중 갈산은 가장 널리 연구된 페놀산 중 하나입니다. FP18에 제시된 주요 생리 활성 성분입니다. 한편, 갈산은 FP에서 가장 높은 함량의 성분이기도 합니다. 농도는 일반적으로 1%에서 3%입니다. El-Hussainy et al.19은 갈산이 심장 손상을 제한하고 지질 프로필을 개선하며 심장 염증 마커를 하향 조절할 수 있음을 밝혔습니다. 퀘르세틴과 베타-시토스테롤의 함량은 더 낮지만 일부 연구에서는 지질 수치를 낮추는 효과가 입증되었습니다. 케르세틴은 식물에 널리 존재하는 중요한 플라보노이드로서 항산화, 항염 및 심혈관 보호 효과와 같은 다양한 특성을 가지고 있습니다20. Lu et al.21은 퀘르세틴 농축 주스가 경미한 고콜레스테롤혈증이 있는 건강한 개인의 TC, LDL-C 및 HDL-C 수치를 약화시킬 수 있다고 연구했습니다. 베타 시토스테롤의 경우 임상 연구에 따르면 식물성 스테롤은 고콜레스테롤혈증과 심혈관 질환을 크게 예방할 수 있습니다22,23. Althwab et al.24는 베타-시토스테롤이 HFD 쥐의 지질 프로필과 동맥 형성 지수를 개선할 수 있음을 증명했습니다. FP의 지질 저하 효과는 이 세 가지 성분과 관련이 있을 수 있음을 알 수 있습니다.

또한 Genecards, OMIM 및 TTD 데이터베이스에서 고지혈증 관련 표적 1,552개를 수집했습니다. 134개의 FP 관련 표적을 고지혈증 관련 표적과 일치시킨 후, 62개의 표적이 고지혈증에 대한 FP의 잠재적 표적으로 확인되었습니다(그림 2A). UniProt 데이터베이스에 따르면 교차된 모든 대상은 공식 기호로 정규화되었습니다. 그 후, PPI 네트워크는 STRING(그림 2B) 및 Cytoscape(그림 2C)에 의해 구성되었습니다. 계산 방법의 점수를 결합한 상위 10개 대상은 ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 및 MYC였습니다. 자세한 내용은 보충 그림 3에 나와 있습니다. 이 62개 표적은 모두 추가 분석의 기초가 되며, 이는 대사체학의 결과와 통합됩니다.

GO 및 KEGG 경로는 농축 분석을 통해 수행되었습니다. 표적 수에 따른 상위 15개 경로는 p-value에 따라 분석을 위해 선택되었습니다. GO 농축 결과는 고지혈증에 대한 FP의 생물학적 과정과 분자 기능이 주로 유전자 발현 및 단백질 결합과 관련이 있음을 시사했습니다(그림 2D). KEGG 농축은 FP가 지질 대사 및 죽상경화증(그림 2E)의 과정에 개입할 수 있음을 입증했으며, 이는 FP가 지질 대사에 영향을 미쳐 고지혈증을 완화한다는 것을 의미합니다.

혈장 지질 수치 및 간 지수에 대한 FP의 효과
고지혈증에 대한 FP의 개선된 효과를 테스트하기 위해 먼저 TC, TG, LDL-C, HDL-C 및 간 지수(체중 대비 간 체중의 비율)의 변화를 측정했습니다. NC 투여군과 비교했을 때, HFD 투여군의 마우스는 TC(p < 0.001), LDL-C(p < 0.001) 및 TG(p < 0.05)의 혈장 수치가 유의하게 증가했으며, 이는 장기적인 HFD 중재가 지질 수치를 증가시키고 고지혈증을 유발할 수 있음을 나타냅니다(그림 3).

FP 수성 추출물을 투여한 후 FP_L 및 FP_H 그룹의 TC 수치는 각각 18.8% 및 12.4% 유의하게(p < 0.05) 감소했습니다(그림 3A). FP_L군과 FP_H군의 LDL-콜레스테롤 수치는 각각 13.7%와 21.8% 유의하게(p < 0.05) 감소했다(그림 3B). HDL-C 수준과 관련하여, FP_H 그룹은 HFD 그룹(<strong class="xfig">그림 3C)에 비해 1.81 ± 0.08 mmol/L에서 2.65 ± 0.16 mmol/L로 유의하게(p < 0.01) 증가했다. FP 중재 후 TG 수치는 유의하지 않았지만 HFD 그룹에 비해 감소했습니다(그림 3D). 최근 연구에 따르면 LDL-C/HDL-C 비율의 지수는 심혈관 질환을 예측하는 데 LDL-C 또는 HDL-C 단독보다 더 나은 지수입니다25,26. HFD 그룹과 비교했을 때, LDL-C/HDL-C 비율은 FP_H 그룹(그림 3E)에서 유의하게(p < 0.01) 46.3% 감소했는데, 이는 FP 중재가 나쁜 콜레스테롤을 감소시키고 좋은 콜레스테롤 수치를 증가시킨다는 것을 의미합니다. 주요 지방 대사 기관인 간 무게는 생쥐의 지방 저장을 어느 정도 반영합니다27. 12주 후, FP_L군과 FP_H군의 간 지수는 HFD 투여군에 비해 유의하게(p < 0.01) 감소했다(<strong class="xfig">그림 3F). PC군은 또한 위의 지표에서 다른 정도의 감소를 보였는데, 이는 FP가 스타틴과 유사한 효과를 보였으며 보호 효과는 용량-반응 관계를 보였다.

다양한 임상 연구에서 추출물 또는 전체 FP를 잠시 복용한 후 TC 및 LDL-C 수치가 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다. 한편, HDL-C 수준은 FP28,29의 장기 투여로 현저하게 높아졌습니다. Nambiar와 Shetty30은 FP 주스가 산화된 저밀도 지단백질을 감소시켜 죽상동맥경화증의 위험을 크게 줄일 수 있음을 발견했습니다. Gopa et al.31은 고지혈증 환자에서 FP의 고지혈 저하 효과를 평가하고 이를 심바스타틴과 비교했습니다. FP를 사용한 치료는 TC, LDL-C, TG의 현저한 감소를 가져왔고, HDL-콜레스테롤의 수치는 심바스타틴과 유사하게 유의하게 증가하였다. 본 연구에서 FP와 심바스타틴도 유사한 치료 효과를 보였으며, FP의 LDL-콜레스테롤 저하 효과와 간 복구 작용이 심바스타틴보다 우수했다.

간 조직병리학적 관찰
HFD 마우스의 간 지방증에 대한 FP의 효과는 그림 4에 나와 있습니다. NC 그룹의 간 병리학적 절편은 규칙적인 간세포 형태, 명확하게 정의된 세포 경계, 명백한 지방 액포가 나타나지 않았습니다(그림 4A,B). 이에 비해 HFD 그룹은 혈관 주변에 다양한 크기의 지방 액포가 있었고 세포 부종, 지방 변성, 세포 경계 상실, 세포 수축 및 간세포 괴사를 특징으로 하는 명백한 간 손상을 보였습니다(그림 4C,D). 그림 4E,F> <strong class="xfig"에서 볼 수 있듯이, FP 중재는 특히 FP_L 그룹에서 간 지방증을 개선할 수 있습니다. HFD 그룹과 비교하여 FP_H 그룹(그림 4G,H) 및 PC 그룹(그림 4I,J)은 간 세포 구조의 어느 정도의 회복, 지방 변성 및 지방 액포 감소를 보였습니다. 이는 FP 중재가 HFD로 인한 간 손상으로부터 간 조직을 보호할 수 있음을 의미합니다.

대사체학 프로파일링
혈장 지질 수치 및 간 조직병리학적 관찰에 따르면, 고용량 FP는 저용량 FP보다 고지혈증에 더 나은 영향을 미쳤다. 따라서 NC, HFD 및 FP_H 그룹을 선택하여 신진대사 수준의 변화를 분석했습니다. QC 샘플의 총 이온 크로마토그램은 보충 그림 4에 나타나 있습니다. 데이터의 정확성을 보장하기 위해 RSD 값이 >30%인 특징을 모든 QC 샘플에서 제거했습니다. PCA 및 이온 크로마토그램은 공정 중에 QC 샘플이 안정적임을 반영했습니다(보충 그림 5). 혈장과 간에서 총 626개 및 562개의 특징이 데이터 전처리 후에 결정되었습니다. 이 중 혈장과 간에서 각각 120개와 124개의 대사산물이 KEGG 데이터베이스를 기반으로 확인되었습니다. OPLS-DA 분석을 사용하여 NC, HFD 및 FP_H 그룹 간의 분리를 탐색했습니다. OPLS-DA는 동일한 그룹 샘플이 함께 클러스터링되고 다른 그룹 샘플이 잘 구별되는 것을 보여주었습니다(그림 5A,B). 이러한 결과는 HFD 및 FP 중재가 명백한 대사 변화를 일으켰음을 나타냅니다.

대사 구별에 기여한 잠재적인 차등 대사 산물을 확인하기 위해 NC 대 HFD 및 HFD 대 FP_H에 대한 추가 OPLS-DA 및 t-test 분석을 각각 수행했습니다. OPLS-DA 결과는 잘 구별되었으며 서로 다른 모델 그룹 간에 상당한 차이를 보였습니다14(보충 그림 6). VIP(Variable important in projection) >1 및 p < 0.05를 기준으로 혈장 내 32개의 대사산물은 NC와 HFD 그룹 간의 차별화를 보였으며, 72개의 대사 산물은 HFD와 FP_H 그룹 간의 차별화를 보였습니다. 간에서는 38개의 대사산물이 NC와 HFD 그룹 간의 분화를 보였고, 17개의 대사 산물이 HFD와 FP_H 그룹 간의 분화를 보였다. 마지막으로, 총 16개 및 6개의 대사산물이 혈장과 간에서 FP에 영향을 미치는 HFD 마우스에서 각각 차등 대사산물로 확인되었습니다(보충 그림 7). 이러한 대사 산물에 대한 정보는 표 2에 나와 있습니다.

세 그룹 간의 대사 산물 변화를 시각화하기 위해 히트 맵은 MetaboAnalyst 5.0에 의해 그려졌습니다. 혈장과 간의 모든 차등 대사 산물은 HFD 그룹에서 변화되었고 대부분은 FP 그룹에서 역전되었는데, 이는 FP 중재가 대사 장애를 개선할 수 있음을 나타냅니다(그림 5C,D). 또한 HFD 마우스에서 FP의 대사 경로를 탐색하기 위해 차등 대사 산물을 MetaboAnalyst 5.0으로 가져왔습니다. p 0.10을 기준으로 혈장에서 트립토판 대사에 유의한 영향을 미쳤으며, 이 경로와 관련된 대사 산물은 D-트립토판 및 L-키누레닌(그림 5E)이었습니다. Jung et al.32는 고지혈증이 장기화되면 키누레닌의 혈청 수치를 낮출 수 있다고 연구했습니다. 타우린과 하이포타우린 대사는 간에서 현저한 영향을 받았으며, 관련 대사 산물은 타우린이었다(그림 5F). 타우린은 동물체에서 중요하고 필요한 아미노산입니다. Dong et al.33은 타우린이 혈중 지질의 손상을 약간 감소시키고 HFD로 인한 죽상동맥경화증 위험을 낮출 수 있다고 연구했습니다. 본 연구에서 FP 중재는 L-키누레닌과 타우린의 함량을 증가시켰는데, 이는 지질 수치 감소와 긍정적인 관련이 있어 고지혈증에 대한 FP의 효과를 뒷받침합니다.

네트워크 약리학 및 대사체학의 통합 분석
대사체학(metabolomics)과 결합된 네트워크 약리학의 통합 전략은 질병 메커니즘 및 중재 전략을 연구하는 데 점점 더 필수적이 되고 있습니다. 네트워크 약리학(network pharmacology)과 대사체학(metabolomics) 간의 관련성은 근거가 제한적이지만 확립되었다. 고지혈증에 대한 FP의 메커니즘에 대한 포괄적인 관점을 얻기 위해 네트워크 약리학 및 대사체학을 기반으로 한 상호 작용 네트워크가 구축되었습니다. 차등 대사 산물을 Cytoscape의 MetScape 플러그인으로 가져와서 네트워크 약리학에서 확인된 허브 유전자와 일치시켜 화합물-반응-효소-유전자 네트워크(그림 6)를 수집했습니다. 표 3에서 볼 수 있듯이, 혈장 대사산물에서 L-키누레닌과 코르티코스테론은 지질 과산화를 촉매하고 비알코올성 지방간 질환을 유발할 수 있는 CYP1A1과 관련이 있었다34,35; 영향을 받은 경로는 각각 트립토판 대사와 스테로이드 호르몬 생합성이었습니다. 아세틸콜린은 AChE와 관련이 있으며 글리세로인지질 대사에 영향을 미쳤습니다. 간 대사 산물에서 MGAM과 라피노스는 갈락토오스 대사와 관련이 있었습니다. 여러 연구에서 라피노스 계열 올리고당을 섭취하면 HFD 마우스의 대사 장애를 개선할 수 있음이 입증되었습니다36.

또한 ingredients-targets-metabolites-pathways 네트워크가 구축되었습니다(그림 7). 성분에서 케르세틴이 가장 많은 가장자리를 연결했는데, 이는 FP의 케르세틴이 지질을 낮추는 데 가장 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 위의 통합 분석을 통해 고지혈증에 대한 FP의 주요 표적, 대사 산물 및 경로가 밝혀졌으며, 이는 이 약물의 치료 메커니즘 및 임상 적용에 대한 추가 연구의 기초가 될 수 있습니다.

분자 도킹
선택된 성분과 주요 표적 간의 상호 작용 가능성을 추가로 조사하기 위해 분자 도킹을 사용하여 리간드-활성 부위 상호 작용을 분석했습니다. AutoDock Vina 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 분자 도킹을 수행했으며, 스코어링 함수의 순위에 따라 첫 번째 도킹 포즈를 출력했습니다. 도킹 결과는 그림 8.

통합 분석에서 CYP1A1, AChE 및 MGAM은 차등 대사산물과 관련이 있었으며, 이들은 표적과 대사산물 사이에 다리를 놓았습니다. 표적과 성분 간의 관계를 확인하기 위해 추가 분자 도킹을 수행했습니다. CYP1A1과의 성분 도킹 결과는 다음과 같습니다 : 갈산은 아미노산 잔기 Asn-185, Tyr-187, Asn-219 및 His-500을 통해 4 개의 수소 결합을 형성하고 아미노산 잔기 Tyr-187 ( 그림 8A)을 통해 π-π 적층 상호 작용을 형성했습니다. 케르세틴은 Asn-185, Asn-219 및 His-500, 소수성 상호 작용 및 Tyr-187을 통한 π-π 적층 상호 작용을 통해 3개의 수소 결합을 형성했습니다(그림 8B). 베타-시토스테롤은 Arg-362, Ser-363, Leu-365 및 Arg-464를 통해 4개의 수소 결합을 형성하고 Glu-369 및 Ile-439를 통해 소수성 상호 작용을 형성했습니다(그림 8C). 결합 에너지는 각각 5.3, 7.0 및 7.3 kcal / -mol이었다. AChE와의 상호 작용에서 갈산은 Arg-237, Arg-238 및 Arg-480(그림 8D)과의 수소 결합에 의해 안정화되었습니다. 케르세틴은 Arg-237 및 Phe-474와의 수소 결합, Phe-157과의 소수성 상호 작용 및 Tyr-478과의 π-π 적층 상호 작용에 의해 안정화되었습니다(그림 8E). 베타-시토스테롤은 Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 및 TYR478(도 8F)과의 소수성 상호작용에 의해 안정화되었다. 결합 에너지는 각각 5.0, 6.5 및 8.0 kcal/- mol이었다. MGAM과의 상호 작용에서 갈산은 Ile-1716, Gly-1747 및 Trp-1749와의 수소 결합 및 Tyr-1715 및 Trp-1749와의 소수성 상호 작용에 의해 안정화되었습니다(그림 8G). 케르세틴은 Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 및 Trp-1752와의 수소 결합, Arg-1730과의 수소 결합 및 His-1727과의 π-π 적층에 의해 안정화되었습니다 ( 그림 8H). 베타-시토스테롤은 Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 및 Phe-1560과의 소수성 상호 작용에 의해 안정화되었으며, 결합 에너지는 각각 5.9, 8.1 및 6.9kcal/mol이었습니다. 상호 작용 및 결합 친화도에 대한 자세한 정보는 표 4에 나와 있습니다. 다중 결합 부위와 높은 결합 에너지는 성분과 단백질 표적 사이의 높은 친화도를 설명하며, 이러한 성분이 고지혈증 관련 표적에 작용하여 지질을 낮추는 역할을 한다는 것을 확인합니다.

그림 1: 통합 전략의 개략적 흐름도. 허브 성분 및 유전자는 네트워크 약리학(Network Pharmacology)에 의해 추출되었습니다(Part 1). 고지혈증에 대한 FP의 차등 대사 산물은 혈장 및 간 대사체학에 의해 분석되었습니다(2부). 주요 표적, 대사산물 및 경로는 Part 1 및 Part 2(Part 3)의 통합 분석을 기반으로 식별되고 연결되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 고지혈증에 대한 FP의 효과에 대한 표적 스크리닝, 네트워크 구성 및 농축 분석.(A) FP-고지혈증 표적의 벤 다이어그램. (B) 잠재적 활성 약물-성분-대상-질병 네트워크: 여기에 언급된 다양한 색상 기호: 질병(빨간색), 약물(파란색), 성분(녹색) 및 대상(노란색). (C) STRING에 의한 PPI 네트워크. (D) GO 경로 농축 분석. (E) KEGG 경로 농축 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: HFD 유발 고지혈증이 있는 마우스의 혈장 지질 수치 및 간 지수에 대한 FP의 효과(n = 6).(A) TC 수준. (B) LDL-콜레스테롤 수치. (C) HDL-C 수준. (D) TG 수준. (E) LDL-C/HDL-C 비율. (F) 간 지수.*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 통계적으로 유의한 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 평가한 후 Dunnett의 다중 비교 검정 또는 사후 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: HFD 유발 고지혈증이 있는 마우스의 간 조직에 대한 FP의 효과(H&E 염색). (A,B) NC기, (C,D) HFD기, (E,F) FP_L기, (G,H) FP_H기, (I,J) PC기(n=6). 가뭉치: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: OPLS-DA 점수 플롯, 히트 맵 및 차등 대사 산물의 대사 경로. OPLS-DA 점수는 혈장(A)과 간(B)에 있는 HFD 마우스에 대한 FP의 플롯입니다. 혈장(C)과 간(D)에서 차등 대사 산물의 히트 맵. 혈장(E)과 간(F)에서 차등 대사 산물의 대사 경로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 주요 대사 산물 및 표적의 화합물-반응-효소-유전자 네트워크. 낮은 등급의 노드가 제거되었습니다. 빨간색 육각형, 파란색 원, 둥근 녹색 직사각형 및 회색 다이아몬드는 각각 활성 화합물, 유전자, 단백질 및 반응을 나타냅니다. 주요 표적과 대사 산물이 확대되었습니다. 흰색 배경의 경로는 혈장에서 크게 조절됩니다. 회색 배경의 경로는 간에서 크게 조절됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: ingredients-targets-metabolites-pathways 네트워크. 색상이 어두울수록 연결된 가장자리가 많으며, 이는 노드가 이 네트워크에서 더 중요하다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: FP 성분 및 주요 표적의 상호 작용 다이어그램.(A) CYP1A1에 작용하는 갈산. (B) CYP1A1에 작용하는 케르세틴. (C) CYP1A1에 작용하는 베타-시토스테롤. (D) AChE에 작용하는 갈산. (E) AChE에 작용하는 케르세틴. (F) AChE에 대한 베타 시토스테롤 작용. (G) MGAM에 작용하는 갈산. (H) MGAM에 작용하는 케르세틴. (I) MGAM에 작용하는 베타-시토스테롤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 고지혈증 결과에 대한 FP 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: FP 수성 추출물의 선택된 성분. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 세 그룹 간의 차등 대사 산물. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 주요 표적, 대사 산물 및 경로에 대한 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: FP 성분과 표적 단백질 사이의 결합 부위 및 작용력. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: FP 수성 추출물의 양이온 및 음이온 크로마토그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: BATMAN-TCM에 의한 FP 성분-표적-경로-질병 네트워크. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 네트워크 약리학에서 허브 유전자의 빈도 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 혈장 및 간 QC 샘플의 이온 크로마토그램. 플라즈마 QC 샘플의 대표적인 양극(A) 및 음극(B) 이온 크로마토그램. 간 QC 샘플의 대표적인 양(C) 및 음(D) 이온 크로마토그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 5: 혈장(A) 및 간(B) QC 샘플의 PCA 점수 플롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: 혈장(A 및 B) 및 간(C 및 D) 샘플의 OPLS-DA 점수 플롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 7: 혈장(A) 및 간(B) 샘플의 차등 대사 산물의 벤 다이어그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.