말은 뛰어난 유산소 운동 능력을 가지고 있어 말 골격근을 말 운동 생리학 연구와 포유류 미토콘드리아 생리학 연구 모두에 중요한 조직으로 만듭니다. 이 기사에서는 말 골격근의 미토콘드리아 기능을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 기능(산화적 인산화 및 활성 산소 종의 생성)은 건강과 질병 모두에 중요합니다. 따라서 미토콘드리아 기능을 측정하는 것은 생물 의학 연구의 기본입니다. 골격근은 특히 말과 같이 유산소 능력이 매우 높은 동물에서 미토콘드리아의 강력한 공급원이므로 미토콘드리아 생리학을 연구하는 데 이상적인 과목입니다. 이 기사는 갓 수확한 골격근 미토콘드리아와 함께 동시 형광 측정법과 함께 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 다양한 미토콘드리아 상태에서 기질을 산화시키는 능력을 정량화하고 미토콘드리아 호흡의 고유한 요소의 상대적 용량을 결정하는 방법을 보여줍니다. 테트라메틸로다민 메틸에스테르는 동시 산소 플럭스 단위당 생성된 상대적 막 전위를 계산하여 미토콘드리아의 상대적 효율 계산을 포함하여 기질 산화로 인한 미토콘드리아 막 전위의 생성을 입증하는 데 사용됩니다. ADP를 ATP로 전환하면 마그네슘에 대한 아데닐레이트의 친화도가 다르기 때문에 반응 챔버에서 마그네슘 농도가 변경됩니다. 따라서 마그네슘 그린은 ATP 합성 속도를 측정하는 데 사용할 수 있으므로 산화 인산화 효율(산화에 대한 인산화의 비율[P/O])을 추가로 계산할 수 있습니다. 마지막으로, 과산화수소와 결합하면 형광 생성물(레소루핀)을 생성하는 Amplex UltraRed를 사용하면 미토콘드리아 호흡 중 활성 산소 종 생성의 정량화와 ROS 생성과 동시 호흡 간의 관계를 정량화할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다양한 시뮬레이션 조건에서 미토콘드리아 생리학을 강력하게 정량화할 수 있으므로 이 중요한 세포 구성 요소가 건강과 질병 모두에 기여하는 바를 밝힐 수 있습니다.
서론
진핵 세포의 미토콘드리아는 세포가 일과 유지를 위해 사용하는 ATP의 대부분을 생산한다1. ATP의 미토콘드리아 생산의 핵심 단계는 산소를 물로 전환하는 것이므로, 미토콘드리아와 관련 세포의 대사 능력은 산소 소비량 측정을 통해 자주 정량화된다2. 그러나 미토콘드리아 생리학은 단순한 산소 소비 과정보다 더 복잡하며 이 종점에 대한 의존은 미토콘드리아 기능과 기능 장애가 세포 건강에 미치는 영향에 대한 불완전한 평가를 독점적으로 제공합니다. 미토콘드리아 기능의 완전한 특성화는 산소 소비뿐만 아니라 ATP 및 활성 산소 종(ROS)의 생성에 대한 평가도 필요로 합니다.
주요 미토콘드리아 기능의 추가 측정은 특정 형광단의 사용을 통한 호흡 측정과 동시에 수행될 수 있습니다. 테트라메틸로다민 메틸에스테르(Tetramethylrhodamine methylester, TMRM)는 미토콘드리아 막횡단 전압 전위에 비례하여 미토콘드리아 기질에 축적되는 양이온성 형광단으로, 이 축적으로 인해 형광 강도가 감소한다3. TMRM은 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 나타내는 지표로 사용되거나, 형광 신호를 mV로 변환할 수 있는 상수....
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프로토콜
이 연구는 오클라호마 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 4개의 서러브레드 겔딩(17.5 ± 1.3년, 593 ± 45kg)을 사용하여 대표적인 결과를 생성했습니다.
1. 골격근 생검 표본 얻기
- 반건공룡근(또는 다른 관심 근육)의 중심에서 골격근 생검(멸균 기술 따름)을 얻고, 가벼운 진정 상태에서 12G UCH(University College Hospital) 생검 바늘( 재료 표 참조)을 사용하고, 이전에 발표된 보고서11에 따라 국소 마취를 사용합니다.
- 생검 표본을 즉시 빙냉 생검 수송 배지 용액(2.77mM CaK 2-EGTA, 7.23mM K2-EGTA, 20mM 이미다졸, 20mM 타우린, 50mM K-MES, 0.5mM 디티오트레이톨, 6.56mMMgCl2, 5.77mM ATP 및 15mM 포스포크레아틴, pH 7.1로 조정됨; 재료 표 참조)으로 바이알에 옮깁니다. 분석을 위해 실험실로 이송합니다.
참고: 생검 수송 배지 준비에 대한 구체적인 지침은 Do....
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결과
제안된 기준 상태는 건강한 좌식 서러브레드(의무 운동으로 인한 체력 증가 없음)와 자세 근육의 중심에서 수집된 신선한 근육 샘플로, 높은 비율의 미토콘드리아가 풍부한 I형 골격근 섬유를 함유하고 휴식 신진대사에 가까운 조건(즉, 38°C 및 pH 7.0). 이러한 조건에서 연구자는 2.71 ± 0.90의 LN 값, 62.40 ± 26.22의 PN 값, 93.67 ± 34.76의PN+S 값 및 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1의 PS 값을 예상할 수 있습니다(그림 3 및 그림 4). TMRM과 함께 배양된 미토콘드리아의 호흡 값은 형광단의 억제 효과로 인해 더 낮습니다(그림 1). FCR누출
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토론
고분해능 호흡기의 표준 출력에 형광 신호를 추가하면 미토콘드리아 생리학에 관한 귀중한 정보를 얻을 수 있지만, 형광 신호의 세심한 보정은 양질의 데이터를 위해 매우 중요합니다. MgG 사용에 대한 원래의 프로토콜은 마그네슘-아데닐레이트 해리 상수를 계산하는 동안 생성된 검량선이 후속 분석에 적용될 수 있음을 시사한다4; 그러나 MgG의 형광 신호는 이 접근법에 대한 분석에서 분석으로 충분히 재현되지 않을 수 있습니다. 따라서 각 분석은 자동화된MgCl2 적정으로 보정되고 해당 개별 분석에 대한 ATP 합성을 계산하기 위한 결과 보정 곡선이 표시됩니다. 또한, 마그네슘과 ADP 및 ATP에 대한Kd (해리 상수)는 ATP 합성 속도의 유도가 정확한지 확인하기 위해 특정 조직, 배양 조건 및 인산화 호흡을 생성하는 기질을 포함한 분석의 특정 조건에 대해 계산되어야합니다. AmR 분석의 가변성은 더 널리 인식되고 있으며(.......
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공개 사항
저자는 이 원고와 관련된 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine과 Grayson Jockey Club Research Foundation의 아낌없는 지원에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ADP | 시그마-알드리치(밀리포어시그마) | A5285 | |
| Amplex 울트라레드 | 라이프 테크놀로지 | A36006 | |
| ATP | 시그마-알드리치(밀리포어시그마) | A2383 | |
| BSA | 시그마-알드리치(밀리포어시그마) | A6003 | |
| 탄산칼슘 | 시그마-알드리치(밀리포어시그마) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | O2K 형폐량계 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| 글루타메이트 | 시그마-알드리치 (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | 시그마-알드리치 (MilliporeSigma) | H7523 | |
| 양고추냉이 과산화효소 | 시그마-알드리치 (MilliporeSigma) | P8250 | |
| 과산화수소 | 시그마-알드리치 (MilliporeSigma) | 516813 | 이 |
| 미다졸 | 시그마-알드리치 ( MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| 만니톨 | Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma) | M9647 | |
| 미토콘드리아 분리 키트 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K 형폐활량계 | Oroboros Inc | 전체 스펙트럼의 분석을 동시에 실행하려면 여러 장치가 필요합니다. | |
| 포스포크레아틴 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | P7936 | |
| 수산화칼 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | P1767 | |
| 락토바이오네이트 칼 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | L2398 | |
| 인산칼 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | P0662 | |
| 피루베이트 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | P2256 | 분석 전에 매일 새로 만들어야 합니다 |
| 로테논 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | R8875 | |
| 숙시네이 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | S2378 | |
| 자당 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | 84097 | |
| 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 | 시그마-알드리치(MilliporeSigma) | S8160 | |
| 타우린 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| 적정 펌프 | Oroboros Inc | ||
| 적정 주사기 | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH 생검 바늘 | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | 다양한 크기로 제공 |
참고문헌
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introdu....
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재인쇄 및 허가
