방법 논문

닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성

DOI:

10.3791/65090

⸱

2023년 2월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 신장 오가노이드는 성인 신장의 것과 어느 정도 유사한 네프론 유사 구조를 포함합니다. 불행하게도, 그들의 임상적 적용 가능성은 기능적 맥관 구조의 부족과 결과적으로 시험관 내 성숙이 제한되어 방해를 받습니다. 닭 배아의 celomic cavity에 신장 오가노이드를 이식하면 사구체 모세 혈관 형성을 포함하여 관류 된 혈관에 의한 혈관 형성을 유도하고 성숙을 향상시킵니다. 이 기술은 매우 효율적이어서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다. 이 논문은 닭 배아에서 신장 오가노이드의 뇌내 이식에 대한 자세한 프로토콜을 설명한 후 관류된 혈관 구조를 염색하기 위해 형광 표지된 렉틴을 주입하고 이미징 분석을 위해 이식된 오가노이드를 수집합니다. 이 방법은 오가노이드 혈관화 및 성숙을 유도 및 연구하여 시험관 내에서 이러한 과정을 향상시키고 질병 모델링을 개선하기 위한 단서를 찾는 데 사용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 신장 오가노이드는 발달 연구 1,2,3,4, 독성 스크리닝 5,6 및 질병 모델링5,7,8,9,10,11,12,13에 대한 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다 . 그러나 이러한 목적 및 궁극적인 임상 이식 목적에 대한 적용 가능성은 혈관 네트워크의 부족으로 인해 제한됩니다. 배아 신장 발달 동안 족세포, 간질 세포 및 혈관 내피 세포(EC)가 상호 작용하여 사구체의 복잡한 구조를 형성합니다. 이러한 상호 작용이 없으면 족세포, 사구체 기저막(GBM) 및 EC로 구성된 사구체 여과 장벽이 제대로 발달할 수 없습니다14,15,16. 시험관 내 신장 오가노이드에는 일부 EC가 포함되어 있지만, 이들은 적절한 혈관 네트워크를 형성하지 못하고 시간이 지남에 따라 감소합니다17. 따라서 오가노이드가 미성숙한 상태로 남아 있는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 마우스에서의 이식은 신장 오가노이드 18,19,20,21의 혈관화 및 성숙을 유도한다. 안타깝게도 이것은 많은 수의 오가노이드 분석에 적합하지 않은 노동 집약적인 공정입니다.

닭 배아는 한 세기 이상 혈관 형성과 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다22. 그들은 쉽게 접근 할 수 있고, 유지 보수가 적고, 완전한 기능을 가진 면역 체계가 부족하며, 달걀 껍질을 연 후에 정상적으로 발달 할 수 있습니다23,24,25,26. 융모막(chorioallantoic membrane, CAM)에 오가노이드를 이식하면 혈관 형성이 일어나는 것으로 나타났다27. 그러나 CAM의 이식 기간과 이식편의 성숙 수준은 CAM 형성에 의해 제한되며, 이는 배아 7 일까지 완료됩니다. 따라서 최근 닭 배아에서 뇌내이식을 통해 신장 오가노이드를 효율적으로 혈관화하고 성숙시키는 방법이 개발되었다28. 닭 배아의 백두강은 1930년대부터 배아 조직의 분화에 유리한 환경으로 알려져 왔다29,30. 배아 발달 초기에 접근할 수 있으며 이식편을 모든 방향으로 비교적 무제한으로 확장할 수 있습니다.

이 논문은 4일차 닭 배아의 celomic cavity에 hiPSC 유래 신장 오가노이드를 이식하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 향상된 성숙을 유도합니다. 배아를 희생하기 전에 형광 표지된 수정체 쿨리나리스 응집소(LCA)를 주입하면 컨포칼 현미경을 통해 오가노이드 내의 관류된 혈관을 시각화할 수 있습니다.

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프로토콜

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네덜란드 법에 따라이 연구에는 동물 복지위원회의 승인이 필요하지 않았습니다.

1. 이식을 위한 hiPSC 유래 신장 오가노이드 준비

  1. Takasato et al.4,18,31에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 hiPSC를 신장 오가노이드로 구별합니다. 분화 7일 + 12일까지 0.4μm 공극이 있는 폴리에스터 세포 배양 삽입물(세포 배양 삽입물)에서 이 프로토콜에 따라 오가노이드를 배양합니다. 각 세포 배양 삽입물에는 3개의 오가노이드가 포함됩니다.
  2. 세포 배양 삽입물에서 오가노이드를 제거합니다.
    1. 한 쌍의 해부 집게로 세포 배양 삽입물의 막 중간에 구멍을 뚫습니다. 해부 가위를 사용하여 세포 배양 삽입물의 중간에 있는 구멍에서 가장자리까지 막을 세 번 절단하여 오가노이드 사이를 절단합니다. 이렇게 하면 각각 하나의 오가노이드가 부착된 3개의 멤브레인 조각이 생성되며, 이 멤브레인은 여전히 바깥쪽 가장자리의 세포 배양 삽입물에 연결되어 있습니다.
    2. 한 쌍의 집게로 바깥쪽 가장자리에 가까운 막 조각 중 하나를 잡고 세포 배양 삽입물에서 떼어냅니다. 오가노이드가 부착된 멤브레인 조각을 페트리 접시에 넣습니다. 탈수를 방지하기 위해 칼슘과 마그네슘(DPBS-/-)이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 오가노이드에 몇 방울 떨어뜨립니다. 다른 두 오가노이드에 대해 반복합니다.
  3. 집게로 멤브레인을 제자리에 고정하고 양날 스테인리스 스틸 면도날로 오가노이드를 반으로 절단하여 이등분합니다(전체 오가노이드가 너무 커서 셀롬이 이 발달 단계에서 수용할 수 없음). 경막 해부기로 두 개의 오가노이드 반쪽을 멤브레인에서 부드럽게 밀어냅니다. 멤브레인을 버리고 이식할 때까지 오가노이드를 DPBS-/- 에 그대로 두십시오.
    참고: 이식 전에 오가노이드에 대한 스트레스를 피하기 위해 이식을 위해 한 번에 최대 3개의 오가노이드를 준비합니다. 이상적으로는 한 사람이 오가노이드를 준비하고 다른 사람이 이식을 수행하는 것이 좋습니다.

2. 이식을 위한 닭 배아 준비

  1. 수정 된 흰 레그혼 알을 품으십시오. 이식의 정확한 시기를 보장하기 위해 신장 오가노이드 분화 7 + 8일에 난자의 배양을 시작합니다.
    1. 수정된 흰 레그혼 알(Gallus domesticus) 을 홀더에 수평으로 놓습니다(그림 1A; day 0), 위쪽을 향한 면의 중간을 연필로 표시합니다.
      알림: 맞춤형 플라스틱 홀더 또는 계란 상자를 계란을 배양하는 홀더로 사용할 수 있습니다.
    2. 계란이 든 홀더를 38ºC ± 1ºC의 가습 인큐베이터에 넣습니다(그림 1A; 0일).
    3. 인큐베이터의 물통을 채운 상태에서 3 일 동안 알을 품으십시오.
  2. 부화 3 일째에 달걀 껍질에 창을 만듭니다.
    1. 배양 3일째에 알의 뾰족한 끝(작은 끝)에 작은 조각(~1cm x 0.5cm)의 투명 테이프를 붙입니다. 투명 테이프 중간의 달걀 껍질에 작은 구멍을 뚫어 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려주세요.
    2. 난황낭이 손상되지 않도록 5mL 주사기에 19G 바늘을 45° 각도로 구멍에 삽입하고 난자에서 2-3mL의 알부민을 흡인하여 난자 내부의 배아를 낮춥니다. 두 번째 투명 테이프(~1cm x 0.5cm)로 구멍을 막습니다.
    3. 달걀의 연필 표시가 있는 위쪽을 향한 면에 큰 조각(~5cm x 5cm)의 투명 테이프를 붙입니다. 투명 테이프 중간에 달걀 껍질에 구멍을 뚫고 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려 구멍을 뚫습니다(그림 1A; 3일차).
    4. 이 구멍에서 시작하여 구부러진 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질에 작은 원형 창을 자릅니다. 이 창을 통해 배아를 찾은 다음 창을 확대하여 배아에 대한 접근을 최적화합니다(그림 1A; 3일차).
    5. 집게를 사용하여 배아 위에 떨어졌을 수 있는 큰 달걀 껍질 조각을 제거합니다. 플라스틱 이식 피펫으로 배아에 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS 몇 방울(DPBS+/+)을 떨어뜨린 다음 달걀 껍질이 있는 DPBS+/+를 피펫으로 흡인하여 더 작은 조각을 제거합니다.
    6. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 0.5% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DPBS+/+ 3방울을 계란에 추가합니다.
    7. 배아가 햄버거-해밀턴 단계 23-24 (HH 23-24)32에 있을 때까지 부화 4일까지 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 조각(~5cm x 5cm)의 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉합니다.
      알림: 창을 밀봉하는 것은 배아의 탈수와 죽음을 방지하는 데 매우 중요합니다.
    8. 테이프를 통해 배아를 관찰하여 생존 가능성을 매일 확인하십시오 (탈수를 피하기 위해 테이프를 제거하지 마십시오). 이 부화 첫날 동안 달걀 노른자 색은 배아 사멸 시 밝은 색에서 무광택 노란색으로 변합니다. 죽은 배아는 버리십시오.
    9. 인큐베이터의 물통을 채우십시오.

3. 부화 4일째 뇌내이식

  1. celomic cavity에 접근하기
    1. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다.
    2. 고무 홀더 또는 달걀 상자의 해부 현미경 아래에 달걀을 놓습니다.
    3. 닭 배아는 이제 HH 23-24에 있으며 왼쪽으로 누워 있고 오른쪽은 관찰자를 향하고 있습니다(그림 1A; 4일차). 배아의 오른쪽 날개와 다리 새싹을 찾으십시오., 이 두 개의 사지 새싹 사이에 셀롬이 접근하기 때문입니다. 오른쪽 날개와 다리 새싹 사이의 영역에서 두 쌍의 해부 집게로 잡고 부드럽게 반대 방향으로 당겨 vitelline 막, chorion 및 양막에 연속적으로 구멍을 만듭니다.
      참고: 바이텔린 막은 난자를 연 후 가장 먼저 만나는 막이며, 경우에 따라 3일째에 창을 만든 후 이미 손상되었습니다. 배아가 회전하면 왼쪽이 관찰자를 향하도록 오른쪽으로 누워 있습니다(그림 1A; 4 일째), 이식을 가능하게하기 위해 그것을 돌릴 필요가 있습니다. 이렇게하려면 vitelline과 chorion 막에 큰 구멍을 만든 다음 집게를 사용하여 배아를 조심스럽게 돌립니다.
    4. celomic cavity에 방해받지 않는 접근이 있는지 확인하십시오 : 한 쌍의 해부 집게로 날개와 사지 봉오리 사이의 체벽 가장자리를 부드럽게 잡고 뷰어쪽으로 약간 당깁니다. celomic cavity는 명확하게 볼 수 있어야합니다. 뭉툭하지만 가느다란 기구(예: 마이크로 메스 홀더의 뭉툭한 텅스텐 와이어)를 셀로믹 캐비티에 조심스럽게 삽입합니다.
      알림: 무딘 기구를 셀로믹 캐비티에 삽입할 수 없는 경우 하나 이상의 멤브레인이 제대로 열리지 않았음을 의미합니다.
  2. 이식
    1. 경막 해부기를 사용하여 알란토스 위에 계란 안에 오가노이드 반을 놓습니다.
    2. 해부 집게를 사용하여 체벽의 가장자리를 조심스럽게 잡고 보는 사람 쪽으로 약간 당겨 셀롬의 개구부가 보이도록 합니다.
      알림: 체벽의 혈관을 손상시키지 마십시오.
    3. 마이크로 메스 홀더의 뭉툭한 텅스텐 와이어를 사용하여 오가노이드를 체벽의 구멍을 통해 셀롬으로 부드럽게 움직입니다. 오가노이드를 두개골로 약간 밀어 셀롬 안에 넣습니다. 이제 날개 봉오리 바로 뒤에서 볼 수 있습니다(그림 1A; 4일차).
    4. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 계란에 DPBS+/+ 3방울을 추가합니다.
    5. 알을 배양 12일(이식 후 8일)까지 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 조각(~5cm x 5cm)의 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉합니다.
    6. 테이프를 통해 배아를 관찰하여 생존 가능성을 매일 계속 확인하십시오(탈수를 피하기 위해 테이프를 제거하지 마십시오). 죽은 배아는 버리십시오.
      참고: 배아와 그들의 융모막이 성장함에 따라 테이프를 통해 더 명확하게 보입니다. 배아의 움직임 부족과 붕괴되거나 희박한 혈관은 배아 사멸의 징후입니다.
    7. 인큐베이터의 물통을 매일 확인하고 채우십시오.

4. 형광 표지된 렉틴 주입

  1. 주사 준비
    1. 열 533, 당기기 60, 속도 150, 시간 200 설정으로 마이크로피펫 풀러에서 유리 미세모세관을 당겨 유리 미세 주입 바늘을 만듭니다. 해부 현미경을 통해 보면서 해부 집게를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 조심스럽게 떼어 내고 구멍을 만듭니다.
      알림: 마이크로피펫 풀러에 필요한 설정은 기계에 따라 다를 수 있습니다.
    2. 주입 시스템을 조립합니다. 38cm 실리콘 튜브 두 개를 가져다가 그 사이에 0.2μm 필터를 끼워 서로 연결합니다. 필터 배출구(실리콘 튜브 1)와 연결된 튜브 끝에 마우스피스를 삽입하고 필터 흡입구(실리콘 튜브 2)와 연결된 튜브 끝에 커넥터를 삽입합니다. 마지막으로 미세 주입 바늘을 커넥터에 삽입합니다(그림 1B).
    3. 형광 표지된 수정체 쿨리나리스 응집소(LCA)를 DPBS-/-로 2.5mL 튜브에서 1mg mL-0.5 농도로 희석하고 미세 원심분리기에서 ~30초 동안 회전시켜 응집체를 튜브 바닥으로 이동합니다.
    4. 20 μL의 LCA를 파라필름 조각에 피펫팅합니다.
    5. 파라필름에서 조립된 주입 시스템의 미세모세관 바늘로 20μL의 LCA를 흡인합니다.
  2. 주사
    1. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 고무 홀더의 해부 현미경 아래에 계란을 놓습니다.
    2. 혈관 구조를 평가하고 약간 더 밝은 붉은 색으로 동맥과 구별할 수 있는 정맥을 찾습니다(그림 1A; 12일째). 혈관 구조에 대한 접근성을 높이려면 구부러진 해부 가위로 절단하여 창을 조심스럽게 확대하십시오. 접근성과 크기에 따라 주사할 정맥을 선택합니다.
    3. 미세모세관 바늘의 끝을 선택한 정맥에 0°-20º 각도로 삽입합니다. 팁을 좌우로 부드럽게 움직여 바늘이 정맥에 있는지 확인합니다. LCA를 주입하기 위해 주입 시스템에 부드럽고 꾸준히 불어넣습니다(그림 1A; 12일째).
      알림: 정맥의 바늘이 올바른 위치에 있으면 정맥의 경계 내에 있어야 합니다.
    4. LCA가 순환할 수 있도록 계란을 인큐베이터에 10분 동안 다시 넣습니다.
      알림: 이 시간 동안 계란을 테이프로 밀봉할 필요는 없습니다.

5. 배양 12일째에 이식된 오가노이드 수집

  1. 닭 배아 희생
    1. 계란을 벤치의 고무 홀더에 넣으십시오. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 그런 다음 구부러진 해부 가위로 배아를 둘러싼 막을 자릅니다.
      참고: 이 단계에는 해부 현미경이 필요하지 않습니다.
    2. 구멍이 뚫린 숟가락으로 난자에서 배아를 긁어 내고 즉시 가위를 사용하여 배아를 참수하십시오. 배아의 몸을 해부 현미경 아래의 페트리 접시에 놓습니다.
  2. 오가노이드 찾기 및 수집
    1. 배아를 페트리 접시에 넣고 팔다리를 펼칩니다.
    2. 집게를 사용하여 세로축을 따라 배아의 복벽을 조심스럽게 엽니 다.
    3. 배아 내부에서 오가노이드를 찾습니다. 오가노이드는 꼬리 끝 또는 흉곽 바로 아래 두개골의 오른쪽 간엽에 가장 자주 부착됩니다(그림 1A; 12일째). 따라서 이러한 위치를 살펴보는 것부터 시작하는 것이 좋습니다.
    4. 오가노이드를 찾으면 미세 가위로 주위를 잘라 배아에서 제거합니다. 오가노이드와 필연적으로 부착되는 닭 조직을 해부 현미경 아래 페트리 접시에 넣습니다. 양날 스테인리스 스틸 면도날로 닭 조직을 최대한 제거하십시오.
    5. 원하는 분석에 따라 오가노이드를 처리합니다.

6. 전체 마운트 면역형광 염색

  1. 이식된 오가노이드를 24웰 플레이트에 넣고 4°C에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 500μL에 고정합니다. DPBS로 3번 세척-/-.
  2. 실온에서 2시간 동안 300μL의 차단 용액(10% 당나귀 혈청 중 0.3% Triton-X-/- 함유 DPBS-/- )에서 오가노이드를 투과시키고 차단합니다.
  3. 1차 항체 혼합물 준비: 1개의 오가노이드에 대해 1차 항체 NPHS1(양-α-인간, 1:100 희석), CD31(mouse-α-human, 1:100 희석) 및 LTL(비오틴 접합, 1:300 희석) 300μL의 차단 용액. 항체 혼합물을 오가노이드에 첨가하고 4°C에서 72시간 동안 인큐베이션합니다.
  4. DPBS-/-에서 3% TritonX로 0.3배 세척합니다.
  5. 2차 항체 혼합물 준비: 1개의 오가노이드에 대해 2차 항체인 donkey-α-sheep Alexa Fluor 647(1:500 희석), donkey-α-mouse Alexa Fluor 488(1:500 희석) 및 streptavidin Alexa Fluor 405(1:200 희석)를 300μL의 차단 용액에 희석합니다. 2차 항체 혼합물을 오가노이드에 넣고 실온에서 2-4시간 동안 배양합니다. 2차 항체가 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.
  6. DPBS로 3번 세척-/-.
  7. 35mm 유리 바닥 접시에 ~30μL의 장착 매체에 오가노이드를 삽입하고 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 밤새 건조시킵니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  8. 컨포칼 현미경을 사용한 이미지.

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결과

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hiPSC를 신장 오가노이드로 분화하는 방법과 일정, 수정된 닭 알의 배양, 신장 오가노이드의 이식, LCA 주입 및 오가노이드 수집을 위한 방법이 그림 1A에 요약되어 있습니다. 오가노이드 분화와 닭고기 달걀 부화의 시기를 조정하고 부화 15일 전에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 배양 0일, 3일, 4일, 12일의 행동은 타임라인 아래의 사진으로 설명됩니다. 오가노이드는 분화 7일째 + 12일째에 4일째(HH 23-24) 닭 배아로 이식됩니다. LCA는 이식 후 8일 후에 배아의 정맥계에 주입하여 관류된 혈관 구조를 염색한 후 배아를 희생하고 오가노이드를 회수합니다. 조립된 사출 시스템은 그림 1B에 나와 있습니다.

닭 배아는 배양 12일째에 희생된다(도 1A). 배아를 조심스럽게 해부하면 이식된 오가노이드가 일반적...

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토론

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이 원고에서는 닭 배아에서 hiPSC 유래 신장 오가노이드의 뇌내 이식을 위한 프로토콜이 시연됩니다. 이식 시 오가노이드는 인간 오가노이드 유래 EC와 닭 유래 EC의 조합으로 구성된 관류 혈관에 의해 혈관화됩니다. 이들은 오가노이드 전체에 퍼져 사구체 구조를 침범하여 EC와 족세포 사이의 상호 작용을 가능하게 합니다. 이전에 이것이 오가노이드 사구체 및 관형 구조의 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다28. 이식은 배아당 ~5분이 소요되는 매우 효율적이며 배아에 필요한 유일한 유지 관리는 인큐베이터의 물동이를 정기적으로 채우는 것입니다. 따라서 이 방법은 많은 수의 오가노이드 분석에 매우 적합합니다.

신장 오가노이드의 혈관화 및 성숙은 이전에 마우스18,20에서의 이식을 통해 입증되었습니다. 이러한 노동 집약적인 마우스 모델에서 오가노...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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닭 배아 주입에 도움을 준 George Galaris(LUMC, Leiden, Netherlands)에게 감사드립니다. 우리는 Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, the Netherlands), Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, the Netherlands)의 지원을 인정합니다. M. Koning은 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'에 의해 지원됩니다. 이 작업은 Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02의 일부 지원을 받았습니다. 이 작업은 RegMedXB (Regenerative Medicine Crossing Borders)와 Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health의 파트너가 지원합니다. C.W. van den Berg와 T.J. Rabelink는 Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine(reNEW)의 지원을 받고, Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine은 Novo Nordisk Foundation 보조금(NNF21CC0073729)의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로; m 필터: Whatman Puradisc 30 주사기 필터 0.2 &마이크로; mWhatman10462200
35mm 유리 바닥 접시 MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
아스피레이터 튜브 어셈블리 보정된 마이크로캐필러리 피펫용Sigma-AldrichA5177-5EA실리콘 튜브, 입 부분 및 커넥터 포함
컨포칼 현미경: Leica White Light Laser Confocal Microscope 라이카TCS SP8
절개 겸자, 심플 타입. 티타늄, 곡선, 미세하고 날카로운 팁이 있는Hammacher KarlHAMMHTC091-10
해부 겸자, 심플 타입. 티타늄, 직선, 세밀하고 날카로운 팁이 있는Hammacher KarlHAMMHTC090-11
해부 현미경 Wild Heerbrugg355110
해부 가위, 곡선, OP-특수, 매우 날카롭고 날카로운Hammacher KarlHAMMHSB391-10
당나귀 세럼Sigma-AldrichD9663
당나귀-알파;-마우스 Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02희석 1:500
당나귀-알파;-양 Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448희석 1:500
양단 스테인리스 스틸 면도날Electron Microsopy Sciences72000
DPBS, 칼슘, 마그네슘 (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
계란 상자 또는 맞춤 제작 계란 홀더 NA
NA 수정된 흰다리뿔 알 (Gallus Gallus Domesticus) 드로스트 루스드레히트 변환기
인큐베이터Elbanton BVET-3 콤비
로터스 테트라고놀로버스 렉틴(LTL) 비오틴화벡터 연구소B-1325희석 1:300
마이크로 가위, 직선, 날카로움/날카로움, 절단 길이 10mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
미세 모세관: 얇은 벽 유리 모세관 1.5mm, 필라멘트World Precision InstrumentsTW150F-3
마이크로피펫 풀러Sutter Instrument Company모델 P-97우리는 다음 설정을 사용합니다: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel 홀더: Castroviejo 블레이드 및 핀 홀더, 12cm, 원형 핸들, 원추형 10mm 턱.EuronexiaL-120
장착 매체: Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona dura dissector 18 cm 레다41146-18
파라필름 Heathrow ScientificHS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mLThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon EuronexiaS-20-P
페트리 접시 60 x 15 mm CELLSTAR628160
플라스틱 이송 피펫 ThermoFisher ScientificPP89SB
정제 마우스 anti-human CD31 항체BD Biosciences555444희석 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042이 제품은 최근에 단종되었습니다. Vectorlabs는 여전히 Dylight 649 표지 LCA (DL-1048-1) 및 플루오레세인 표지 LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 항체R& D 시스템AF4269희석 1:100
멸균 피하 주사 바늘, 19 GBD 마이크로랜스301500
Streptavidin Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351희석 1:200
주사기 5 mLBD 에메랄드307731
투명 테이프 철물점에서 사용 가능한Tesa4124
Triton XSigma-AldrichT9284
텅스텐 와이어, 지름 0.25mm 써모피셔 사이언티픽010404.H2
NA대부분의

참고문헌

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