인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

Martino Guiotto; Silvia Palombella; Stefania Brambilla; Lee Ann Applegate; Mathis Riehle; Andrew Hart; Wassim Raffoul; Pietro Giovanni di Summa

doi:10.3791/65104

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방법 논문

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

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DOI:

10.3791/65104

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2023년 2월 3일

Martino Guiotto^*¹^,⁴ , Silvia Palombella^*² , Stefania Brambilla² , Lee Ann Applegate³ , Mathis Riehle⁴ , Andrew Hart⁴ , Wassim Raffoul¹ , Pietro Giovanni di Summa¹

¹Department of Plastic, Reconstructive and Hand Surgery, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV, ²Cell and Tissue Engineering Lab, IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio, ³Unit of Regenerative Therapy, Plastic, Reconstructive and Hand Surgery, Department of Musculoskeletal Medicine, Lausanne University Hospital, ⁴Centre for the Cellular Microenvironment, University of Glasgow

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

초록

줄기 세포 치료의 증가하는 영향을 고려할 때, 체외 조작 중 동물 유래 제품의 도입으로 인한 잠재적 오염 또는 감염 전파에 대한 생물학적 안전성 문제가 제기되었습니다. 세포 분리 및 확장 단계에서 일반적으로 사용되는 콜라게나제 또는 소 태아 혈청과 같은 이종 성분은 수용 환자의 면역 반응성 또는 바이러스, 박테리아 및 프리온 감염의 잠재적 위험과 관련될 수 있습니다. Good Manufacturing Practice 지침에 따라 화학적 조직 해리를 피해야 하며 소 태아 혈청(FBS)은 이종성이 없는 보충제로 대체할 수 있습니다. 또한, 셀 제품의 안전성을 보장하기 위해서는 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법의 정의가 중요합니다. 우리는 콜라겐 분해 효소 FBS 배양 표준 프로토콜과 비교하여 특성을 변경하지 않고 인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 확장을 위한 혁신적이고 완전히 이종 발생이 없는 방법을 개발했습니다. 여기서, 복부 지방 조직으로부터 인간 지방유래 줄기세포(hASCs)를 분리하였다. 샘플을 가위/메스로 기계적으로 다진 후 미세 해부하고 10cm 페트리 접시에 기계적으로 분산시킨 다음 메스 절개로 준비하여 조직 조각의 부착과 hASC의 이동을 용이하게 했습니다. 세척 단계에 따라, hASC는 효소 소화 없이 소성 부착으로 인해 선택되었습니다. 분리된 hASC를 5% 헤파린이 없는 인간 혈소판 용해물이 보충된 배지로 배양하고 동물이 없는 트립신 대체물로 분리했습니다. 인간 치료용 세포 제품 생산에 대한 GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 모든 배양 배지에 항생제를 사용하지 않았습니다.

서론

지난 수십 년 동안 혁신적인 치료법에 대한 수요가 증가함에 따라 중개 의학 분야에 상당한 노력과 자원 투자가 이루어졌습니다¹. 세포 기반 제품은 세포 공급원, 제조 공정(분리, 확장 또는 유전자 변형) 및 비세포 보충제(효소, 성장 인자, 배양 보충제 및 항생제)에 의해 결정되는 위험과 관련이 있으며 이러한 위험 요소는 특정 치료 적응증에 따라 다릅니다. 최종 제품의 품질, 안전성 및 효능은 위에 명시된 요소²에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 줄기 세포 치료는 생물 안전 원칙을 준수해야합니다. 세포 배양에서 동물 유래 제품으로 인한 병원성 전파의 잠재적 위험은 문제가 될 수 있으며 제조에 도입된 모든 제품에 대한 철저한 테스트가 필수적입니다³.

인간 지방유래 줄기세포(hASC)를 분리하는 전통적인 방법은 콜라게나제(collagenase)를 이용한 효소 분해 후 원심분리를 통한 세척 단계를 거친다⁴. 효소 분리는 일반적으로 세포 수율 및 생존력 측면에서 다른 기계적 기술보다 더 효율적인 것으로 간주되지만, 콜라게나제와 같은 동물 유래 성분은 미국 식품의약국(FDA)에서....