방법 논문

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

DOI:

10.3791/65172

⸱

2023년 4월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

초록

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성인 중간엽 세포는 최근 수십 년 동안 분자 및 세포 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 그들은 자가 재생, 이동 및 증식을 위한 큰 능력 외에도 다양한 특수 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 세포의 가장 침습적이지 않고 가장 접근하기 쉬운 공급원 중 하나입니다. 또한 다른 공급원에 비해 수율이 높고 면역 조절 특성이 우수한 것으로 보고되었습니다. 최근에, 상이한 조직 공급원 및 동물 종으로부터 성체 중간엽 세포를 얻기 위한 상이한 절차가 발표되었다. 일부 저자의 기준을 평가한 후 다양한 목적에 적용할 수 있고 쉽게 재현할 수 있는 방법론을 표준화했습니다. 신장 주위 및 부고환 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF) 풀을 통해 최적의 형태와 기능을 갖춘 1차 배양을 개발할 수 있었습니다. 세포는 24시간 동안 플라스틱 표면에 부착된 것으로 관찰되었으며, 연장 및 콜로니 형성 경향과 함께 섬유아세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 유세포 분석 (FC) 및 면역 형광 (IF) 기술을 사용하여 막 마커 CD105, CD9, CD63, CD31 및 CD34의 발현을 평가했습니다. 지방 유래 줄기 세포(ASC)가 지방 유래 계통으로 분화하는 능력은 또한 인자 칵테일(4μM 인슐린, 0.5mM 3-메틸-이소-부틸-크산틴 및 1μM 덱사메타손)을 사용하여 평가되었습니다. 48시간 후, 섬유아세포양 형태의 점진적인 손실이 관찰되었고, 12일째에 오일 레드 염색에 양성인 지질 방울의 존재가 확인되었습니다. 요약하면, 재생 의학에 적용하기 위한 최적의 기능적 ASC 배양을 얻기 위한 절차가 제안됩니다.

서론

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중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생, 증식, 이동 및 다른 세포 계통으로의 분화 능력이 높기 때문에 재생 의학에 큰 영향을 미쳤습니다 1,2. 현재 많은 연구가 다양한 질병의 치료 및 진단 가능성에 초점을 맞추고 있습니다.

중간엽 세포의 출처는 골수, 골격근, 양수, 모낭, 태반, 지방 조직 등 다양합니다. 그들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 말3을 포함한 다양한 종에서 얻습니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC)는 재생 의학에서 줄기세포의 주요 공급원이자 배아 줄기 세포 사용의 대안으로 수년 동안 사용되어 왔다4. 그러나 지방 유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 수집 및 분리가 용이하고 지방 조직 5,6 그램 당 얻은 세포의 수율로 인해 큰 이점을 가진 중요한 대안입니다. ASCs의 수확량은 일반적으로 BMSCs의 수확량보다 높다고 보고되었다7. 처음에는 ASC의 회복/재생 능력이 다른 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문이라고 제안되었다8. 그러나 최근 몇 년 동안의 연구는 ASC가 회복 잠재력에서 방출하는 측분비 인자의 주요 역할을 강화했습니다 9,10.

지방 조직(AT)은 에너지를 비축할 뿐만 아니라 내분비계, 신경계 및 심혈관계와 상호 작용합니다. 또한 출생 후 성장 및 발달, 조직 항상성 유지, 조직 복구 및 재생에 관여합니다. AT는 지방세포, 혈관 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 단핵구, 대식세포, 림프구, 지방전구세포 및 ASC로 구성됩니다. 후자는 면역 원성이 낮기 때문에 재생 의학에서 중요한 역할을합니다11,12. ASC는 효소 분해 및 기계적 처리 또는 지방 조직 외식편에 의해 얻을 수 있습니다. ASC의 기본 문화는 유지 관리, 성장 및 확장이 쉽습니다. ASC의 표현형 특성 분석은 면역형광 및 유세포 분석과 같은 방법을 사용하여 특정 막 마커의 발현을 평가함으로써 세포의 정체성을 검증하는 데 필수적이다13. IFATS(International Federation for Adipose Therapeutics and Science)와 ISCT(International Society for Cellular Therapy)는 ASC가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 반면 CD11b, CD14, CD19, CD45 및 HLA-DR14의 발현은 부족하다고 정의했습니다. 따라서 양성 및 음성 모두 이러한 마커는 ASC의 특성화에 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다.

이 프로젝트는 쥐의 AT에서 추출한 성체 중간엽 세포의 분리 및 식별 절차를 설명하는 데 중점을 두었는데, 이 세포 공급원은 배아 줄기 세포와 달리 윤리적 문제를 나타내지 않기 때문입니다. 이것은 골수 유래 줄기 세포에 비해 접근이 용이하고 최소 침습적 방법으로 인해 실행 가능한 옵션으로 절차를 굳건히 합니다.

이 조직 공급원의 중간엽 세포는 면역 조절 능력과 낮은 면역 거부 반응으로 인해 재생 의학에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 본 연구는 그들의 세크레톰과 당뇨병과 같은 대사 질환을 포함한 다양한 질병에서 재생 요법으로서의 적용에 대한 향후 연구의 근본적인 부분입니다.

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프로토콜

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모든 실험 절차는 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico)의 권장 사항에 따라 멕시코 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Instituto Mexicano del Seguro Social의 건강 연구 윤리 위원회(R-2021-785-092)에서 검토, 승인 및 등록했습니다.

1. 외과적 절제술에 의한 쥐의 지방조직 제거

  1. 20mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수-항생제 항진균제(PBS-AA) 용액(1x PBS, 겐타마이신[20μg/mL] 및 암포테리신[0.5μg/mL])으로 두 개의 원뿔형 튜브를 준비하고 얼음 위에 유지합니다.
  2. 건강 상태가 양호한 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (R. norvegicus) 두 마리를 선택합니다. 쥐가 생후 3-4개월 사이이고 코랄 무게가 350-450g인지 확인하십시오.
  3. 자일라진 염산염 20mg/kg으로 진정을 진행하고 5분 후 케타민 염산염 120mg/kg을 복강 주사하여 마취제를 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 안과 용 연고로 양쪽 눈을 윤활하십시오. 그런 다음 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인합니다.
  4. 복부와 사타구니 부위를 요오드 용액으로 면도하고 소독하십시오. 무균 상태를 유지하기 위해 외과 용 커튼을 적용하십시오. 그런 다음 흉골에서 고환 부위까지 중앙 세로 절개를합니다.
  5. 멸균 겸자로 부고환과 신장을 둘러싼 지방 조직을 제거하고 1x PBS-AA 용액에 넣습니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
  6. 기관 지침에 따라 필요한 경우 절개 부위를 봉합하고 40mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 심장 내 용량으로 동물을 안락사시킵니다. 사망이 확인되면 제도적 절차에 따라 시체를 처리한다.
    참고: 죽음은 중간엽 세포의 면역 표현형, 분화 능력 및 측분비 효과에 영향을 미치는 신호 전달 메커니즘을 유도합니다. 따라서 조직 수집은 안락사 전에 수행됩니다. 

2. 지방조직에서 중간엽 세포의 분리

  1. 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 집게로 지방 조직을 제거하고 100mm 직경의 페트리 접시에 멸균 여과지에 올려 과도한 PBS를 흡수합니다.
  2. 지방 조직을 다른 페트리 접시로 옮기고 10mL 피펫을 사용하여 1x PBS-AA 용액 10mL로 각각 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.
  3. 가위와 메스를 사용하여 조직을 약 1cm2 의 조각으로 기계적으로 분해합니다.
  4. 보충되지 않은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 20mL에 콜라게나제 IV형(0.075%)을 준비합니다. 0.22μm 주사기 필터를 통해 여과하고 37°C에서 유지합니다.
  5. 단계 2.4에서 제조된 콜라게나제 용액(20 mL)을 파편화된 조직과 마그네틱 바가 있는 크리스탈 비이커에 넣는다. 용기를 밀봉하고 37°C에서 서서히 연속적인 교반 하에 배양한다.
    참고: 효소 분해에는 약 90분이 소요됩니다(세포막의 무결성을 유지하기 위해 천천히 저어줍니다).
  6. 100mm 페트리 접시의 스테인리스 스틸, 40메쉬, 0.38mm 조리개 필터를 통해 균질액을 여과하고 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
  7. 따뜻하게 하고 보충된 DMEM(10% 소 태아 혈청[FBS], 2mM 글루타민, 2mM 피루브산나트륨, 100x 비필수 아미노산 용액 및 100x 항생제 항진균 용액[AA]) 20mL를 추가합니다. 기질 혈관 분획 (SVE)을 조심스럽게 중단하십시오.
  8. 세포 현탁액을 290 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 25 mL 피펫으로 상청액을 버리고, 40 mL의 비보충 DMEM 배지로 세포를 부드럽게 세척한다.
  9. 이 단계를 반복합니다. 단계 사이에 새로운 멸균 원추형 튜브를 사용하여 세포 찌꺼기와 지방을 최소한으로 끌어냅니다.
  10. 펠릿을 5mL 피펫으로 보충된 DMEM 5mL에 현탁하고 T-25cm2 병으로 옮깁니다. 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
  11. 다음 날, 5mL의 데워진 1x PBS-AA로 3회 세척하고 보충되지 않은 DMEM으로 2회 세척하여 세포 파편과 비부착성 세포를 제거합니다. 5mL 피펫으로 신선하고 따뜻하게 보충된 DMEM 5mL를 추가하고 3-4일마다 배지를 교체합니다.

3. ASC 1차 문화의 유지 및 확장

  1. 세포가 90%-100% 합류(8± 2일)에 도달하면 보충되지 않은 DMEM 5mL로 두 번 세척합니다. 데워진 0.025% 트립신-2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 넣고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.
  2. 세포 단층이 분리되면 보충된 DMEM 4mL를 추가하고 세포 현탁액을 부드럽게 분해합니다.
  3. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 5mL의 따뜻하고 보충된 DMEM을 추가하고 부드럽게 현탁하여 균질화합니다.
  4. 290 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 펠릿을 보충된 DMEM 1mL에 부드럽게 혼합합니다. Trypan blue로 염색한 후 Neubauer 챔버에서 세포를 계수합니다.
  5. 마지막으로 T-75 플라스크에서 2.5 x 103 cells/cm 2 를 1:4의 분할 비율로 시드합니다. 이 단계는 집락 형성과 높은 증식 속도를 보장합니다.

4. ASC 1차 배양의 형태학적 특성

  1. 도립 현미경으로 ASC의 형태를 관찰합니다.
    알림: 조직학 및 ASC 식별을 위해 장착하기 전에 커버슬립을 1% 젤라틴 용액으로 처리하십시오. UV를 15분 동안 조사합니다.
    1. 70% 에탄올 용액에서 커버슬립을 제거하고 5분 동안 건조시킵니다.
    2. 커버슬립을 멸균된 1% 젤라틴 용액에 담그고 물기를 빼고 실온(RT)에서 건조합니다.
    3. 각 커버슬립을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 플레이트에 15분 동안 UV 광선을 조사합니다.
    4. 웰 중앙에 25 x 103 세포가 들어 있는 한 방울을 시딩하고 1분 정도 기다린 후 보충된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 96시간 동안 인큐베이션한다.
    5. 배지를 제거하고 이송 피펫을 사용하여 1x PBS-AA로 3회 세척을 수행합니다.
    6. 3.5% 중성 포르말린 1mL를 각 웰에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 포르말린을 조심스럽게 제거하고 차가운 70% 에탄올 1mL를 각 웰에 추가합니다.
    7. 건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 파라필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
      참고: ASC의 세포 형태는 또한 다른 계대 동안 헤마톡실린-에오신 염색에 의해 평가됩니다.
    8. 각 웰로부터 70% 에탄올을 제거하고, 증류수로 5분 동안 세포를 수화시킨다. 한편, 염색 용액을 여과한다.
    9. 물을 제거하고 Harris의 헤마톡실린 용액으로 15분 동안 천천히 교반하면서 세포를 염색합니다.
    10. 염색 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.
    11. 에오신 용액으로 세포를 1분 동안 천천히 교반하여 염색합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.
    12. 각 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 PBS-글리세롤 장착 용액(1:1 v/v) 한 방울에 슬라이드를 장착합니다.
    13. 커버슬립 주위에 네일 바니시를 한 줄 붙이고 광학 현미경으로 조직학적 슬라이드를 관찰합니다.

5. 면역형광법에 의한 ASC의 발현 마커

  1. 1x PBS-0.05% Tween 20을 함유하는 세척 완충액을 준비한다. RT에서 천천히 흔들어 세탁하십시오. 2mL의 완충액/웰로 플레이트를 세 번 세척합니다(세척할 때마다 3분 동안 배양).
  2. 1mL의 블로킹 시약(1:10)을 넣고 20분 동안 천천히 교반하면서 배양합니다.
  3. CD9(단클론 마우스), CD34(다클론 토끼) 및 항-CD63(다클론 염소)과 같은 1차 항체 200μL(1:50 희석)를 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  4. 플레이트를 다시 세 번 세척하고 다음 2차 항체의 200μL(1:50 희석)와 함께 배양합니다: 항-마우스 IgG FITC 접합 염소, 당나귀 항-염소 IgG DyeLight 550 및 염소 항-토끼 IgG Cy3.
  5. 1x PBS-0.05% Tween 20으로 3회 세척하고 100μL의 DRAQ-7(희석: 이중 증류수 1mL에 17μL)로 세포핵을 20분 동안 대조염색합니다.
  6. 세 번 더 씻고 4.1.12-4.1.13 단계에 따라 슬라이드를 장착합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 냉동하십시오.
  7. 에피형광 컨포칼 현미경 하에서 이 장비에 권장되는 적절한 설정과 소프트웨어를 사용하여 샘플을 시각화합니다.

6. 유세포 분석에 의한 ASC의 발현 마커

  1. 트립신 처리 또는 해동된 세포(하위 계대 3 또는 4)의 단일 세포 현탁액을 1x PBS-5% FBS의 1 x 106 cells/mL 농도로 조정합니다. 1.5mL 원심분리기 튜브에 100,000개 세포와 함께 100μL를 분취합니다. 자동 형광 제어를 위해 라벨링 없이 하나의 분취량을 사용합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 적절한 양의 Anti-CD105 AF-594 및 Anti-CD31 AF-680을 모두 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
  3. 250 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 1mL의 1x PBS-5% FBS로 초과 염색을 세척하고 1% 포르말린 300μL에 현탁합니다.
  4. 유세포 분석기에서 시료 수집을 수행합니다. 셀의 게이팅 전략은 FSC-A 대 SSC-A 게이팅, SSC-H 대 SSC-A를 사용하여 게이팅된 단일 셀, FSC-A 대 FSC-H를 기반으로 합니다.
  5. CD105 AF-594에는 Y610-mCherry-A 검출기를 사용하고 CD31 AF-680에는 R660-APC-A 검출기를 사용합니다.

7. ASC와 지방 생성 계통의 분화

  1. 6-웰 플레이트에서, 시드 1 x 10 cm2 당 4 세포 (P-4) 및 60-80% 합류(~72-96 h)까지 37°C, 5%CO2에서 인큐베이션한다. 4 μM 인슐린, 1 μM 덱사메타손 21-아세테이트(Dxa) 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(MIX)을 배양 배지에 직접 적용하여 분화를 유도합니다. 분화 배지는 2-3일마다 교체하십시오.
  2. 멸균 초순수 2mL에 800μM 인슐린 원액을 준비하고(완전한 용해를 위해 1N HCl 20μL 추가) -20°C에서 보관합니다. 이전에 1:100으로 희석한 인슐린 스톡 10μL를 추가하고 웰당 2mL의 최종 부피로 10μL를 적용합니다.
  3. 멸균 초순수 5mL에 1mM Dxa의 원액을 준비합니다(완전 용해가 일어나지 않음). 4 °C에서 보관하십시오. 40 μL/well의 1:4 희석 Dxa 스톡을 추가합니다.
  4. 2.5mL의 0.1N NaOH에 100mM의 MIX를 준비하고, 와동하고, 완전한 용해를 위해 40μL의 1N NaOH를 추가합니다. -70 °C에서 보관하십시오. 10 μL/well의 MIX 스톡을 추가합니다.
  5. 보관하기 전에 0.22μm 멸균 주사기 필터를 통해 저장 용액을 여과합니다.
  6. 12일째에, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고, RT에서 1시간 동안 4% 포르말린 500 μL로 인큐베이션한다. 증류수로 각 웰을 2회 세척하고, 이어서 60% 이소프로판올을 5분 동안 건조시켰다.
  7. 60% 이소프로판올(500μL/웰)로 희석한 0.5% 오일 레드 O를 넣고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 증류수 1mL로 3회 세척하고 도립 현미경으로 관찰합니다.
    알림: 필요한 시약, 장비 및 재료는 재료 표를 참조하십시오.

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결과

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지방 조직은 생후 3-4개월의 성인 Sprague Dawley 쥐에서 얻었으며 체중은 401g± 41g(기하 평균 ± SD)입니다. 부고환 및 신장 주위 지방 조직의 평균값 3.8 g은 15 개의 실험 추출 분석에 해당한다. 배양 24시간 후, 세포 집단은 플라스틱 표면에 부착된 상태를 유지하고 이질적인 형태를 나타냈습니다. 첫 번째 계대배양은 8 ± 2일째에 실현되었으며, 총 8번의 실험에서 0.6 x 106 세포± 1.4 수율로 실현되었다. 직접 명시야 관찰(그림 1)과 헤마톡실린-에오신 염색(그림 2)은 광학 현미경으로 형태학적 특성 분석을 용이하게 했습니다. 길쭉한 연장과 풍부한 세포 내 미세 필라멘트, 중간 엽 기질 세포의 특징과 함께 광범위한 세포질이 보였습니다.

ASC는 서로 다른 하위 통로(1, 3, 7 및 9)에서 간접 면역형광에 의해 구...

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토론

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중간엽 줄기세포가 발견된 이후 지난 40년 동안 여러 그룹의 연구자들이 다양한 조직과 종에서 중간엽 줄기세포를 얻는 절차를 설명했습니다. 쥐를 동물 모델로 사용하는 장점 중 하나는 유지 관리가 쉽고 발달이 빠르며 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. ASC를 얻기 위한 상이한 조직 공급원, 예컨대 내장, 주위지방, 부고환 및 피하 지방 12,13,14,15,16이 기재되어 있다.

여기에 사용 된 추출 절차와 관련하여 저자는 쥐의 체중이 350-450g 사이 여야하며 생후 첫 4 개월 동안 달성 할 수 있다고 권장합니다. 동물의 체중이 450-600g이고 생후 8개...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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저자는이 프로젝트를 수행하기 위해 제공 된 지원에 대해 멕시코 사회 보장 연구소 (IMSS)와 멕시코 아동 병원, 페데리코 고메즈 (HIMFG) 및 IMSS 연구 조정의 Bioterio 직원에게 감사드립니다. AOC (815290) 장학금에 대한 국립 과학 기술위원회와 시청각 자료에 대한 기술 지원에 대해 Antonio Duarte Reyes에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amphotericin BHyCloneSV30078.01
분석 저울SartoriusAX224
항체 항 CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
항체 항 CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
항체 항 C63Santa CruzSc-5275
항체 항 Endoglin / CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa Cruzsc-18838A594
항체 anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa Cruzsc-18916AF680
항체 염소 anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
항체 당나귀 anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
항체 anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)RD 시스템.No. F103B
보틀 탑 필터 멸균코닝10718003
세포 및 조직 배양 플라스크BIOFIL170718-312B
세포 계수기 Bright-Line 혈구계(세포 계수 챔버 슬라이드 포함SIGMA Aldrich Z359629
Cell well: 뚜껑이 있는 6웰CORNING25810
원심분리기 원추형 튜브HeTTICHROTANA460R
원심분리기 에펜도르프 튜브Fischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
배양 튜브Greiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman Coulter무료 버전
CytoFlex LX 세포분석기Beckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 염료Thermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
에오신 황색Hycel300
에탄올 96%Baker64-17-5
Falcon 튜브 15mLGreiner Bio-One 188271
Falcon 튜브 50mLGreiner Bio-One 227261
소 태아 혈청 CORNING35-010-CV
젤라틴,시그마, 알드리치, 128111163
겐타마이신GIBCO15750045
글리세린-고순도Herschi, 트레이딩56-81-5
AMRESCO 0701-25G
, 헤라셀, 240i, CO2 인큐베이터Thermo Sc.
케타민 애완 동물 (케타민 클로 히드 레이트)아란다SV057430
L- 글루타민 GIBCO / Thermo Sc. 25030-081
LSM 소프트웨어 Zen 2009 V5.5무료 버전
생물 안전 캐비닛 클래스 IINuAire12082100801
에피 형광 현미경 Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
도립 현미경 Olympus CK40CK40-G100
비 필수 아미노산 100XGIBCO11140050
마이크로 튜브 2 mL Sarstedt 72695400
마이크로 튜브 1,5 mLSarstedt 72706400
마이크로 피펫 0.2-2 μ LFinnpipetteE97743
마이크로 피펫 2-20 μ LFinnpipetteF54167
마이크로 피펫 20-200 μ LFinnpipetteG32419
마이크로 피펫 100-1000 μ LFinnpipetteFJ39895
질소 탱크 액체Taylor-Wharton681-021-06
파라포름알데히드SIGMA AldrichSLBC3029V
페니실린/스트렙토마이신 GIBCO/Thermo Sc.
페트리 접시 세포 배양CORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker7447-40-7
Potassium PhosphateDibasic J.T Baker2139900
S1 피펫 필러Thermo Sc9531
혈청 학적 피펫 5 mLPYREXL010005
혈청 학적 피펫 10 mLPYREXL010010
중탄산 나트륨J.T Baker144-55-8
염화나트륨 J.T.Baker15368426
인산 나트륨 이염 기성 무수J.T 베이커7558-79-4
나트륨 피루브산GIBCO BRL11840-048
주사기 필터 멸균CORNING431222
분광 광도계PerkinElmer Lambda 25L6020060
역가 플레이트 쉐이커LAB-LINE1250
트랜스퍼 피펫Samco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue 돼지GIBCO
트립신염색 SIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
유니버설 블로킹 시약 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)Pet' s 제약Q-7972-025
) , , , , 헤라셀, , 5011604715140122 췌장에서 추출한 1198566

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