방법 논문

비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석

DOI:

10.3791/65190

⸱

2023년 9월 8일

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1Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, 2Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 3Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 4FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, 5Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, 6Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

이 논문에서

요약

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비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 치료 관리를 위해 검사해야 하는 분자 바이오마커가 증가함에 따라 빠르고 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법의 개발이 촉진되었습니다. 초고속 차세대 염기서열분석(NGS) 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자에 대한 게놈 변형 평가를 위한 워크플로우를 설명합니다.

초록

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비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 환자의 표적 치료를 위해 검사해야 하는 분자 변형의 수는 지난 몇 년 동안 크게 증가했습니다. 진행성 또는 전이성 NS-NSCLC 환자의 최적 치료를 위해서는 분자 이상 검출이 필수적이며, 이를 통해 표적 치료제를 투여하여 전체 생존율을 개선할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 종양은 새로운 치료법을 사용하여 잠재적으로 표적화할 수 있는 내성 기전을 발달시킵니다. 일부 분자 변화는 치료 반응을 조절할 수도 있습니다. NS-NSCLC의 분자 특성 분석은 국제 지침에서 권장하는 대로 영업일 기준 10일 이내에 짧은 처리 시간(TAT) 내에 수행되어야 합니다. 또한 게놈 분석을 위한 조직 생검의 기원은 다양하며 덜 침습적인 방법 및 프로토콜의 개발로 크기가 지속적으로 감소하고 있습니다. 결과적으로, 병리학자들은 효율적이고 신속한 진단 전략을 유지하면서 효과적인 분자 기술을 수행해야 하는 과제에 직면해 있습니다. 여기에서는 NS-NSCLC 환자의 진단 시 일상 진료에 사용되는 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석(NGS) 워크플로우에 대해 설명합니다. 우리는 이 시스템이 적절한 TAT에서 흉부 종양학의 정밀 의학에 사용되는 현재 분자 표적을 식별할 수 있음을 보여주었습니다.

서론

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지난 10년 동안 표적 및 면역 치료제의 개발로 비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC)의 전체 생존율(OS)이 크게 증가했습니다1,2. 이와 관련하여, NS-NSCLC를 치료할 때 분석해야 하는 필수 유전자 및 분자 표적의 수는 지난 몇 년 동안 증가했습니다 3,4.

현재 국제 가이드라인은 진행성 NS-NSCLC 5 진단 시 EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET 및 MET를 검사할 것을 권장하고있다. 더욱이 최근 신약이 임상시험에서 매우 유망한 결과를 내놓으면서 BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 및 NUT 6,7,8,9와 함께 KRAS 및 HER2와 같은 여러 추가 유전자에서 추가 게놈 변형이 곧 스크리닝될 것입....

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프로토콜

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모든 절차는 지역 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025)의 승인을 받았습니다. 샘플 및 생성된 데이터를 사용하기 위해 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 모든 샘플은 2022년 9월 20일부터 1월 31일까지 LPCE(프랑스 니스)에서 NS-NSCLC 진단을 받은 환자로부터 의료의 일환으로 획득했습니다.

1. 자동 정제 기기(API)를 사용하여 FFPE DNA 및 RNA 샘플 준비(처리 시간: 5시간 15분)

  1. 기기에서 평탄화를 실행합니다.
    1. 계측기의 전원을 켜고 사용자 이름과 암호(자료 표)로 로그인합니다. Run(실행), Add Plan(계획 추가)을 차례로 클릭하고 실행 계획에 이름을 지정하여 정화 실행 계획을 작성하십시오.
    2. 그런 다음 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플에서 DNA 및 RNA를 순차적으로 정제하기 위한 적절한 정제 키트 및 프로토콜을 선택합니다. 정제 후 정량 분석이 가능합니다.<....

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결과

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최근 간행물21에 자세히 설명된 여기에 제시된 절차를 사용하여 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자의 진단을 위해 일상적으로 수행되는 임상 실습에서 반사 검사로서 분자 변화를 평가하기 위한 최적의 워크플로우를 개발했습니다. 이 방법의 분자 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 패널에 포함된 유전자 목록은 보충 그림 1에 나와 있습니다.

분자 분석은 NS-NSCLC 환자 259명을 대상으로 수행되었습니다. 여기에는 기관지 생검 153건, 경흉부 생검 47건, 수술 검체 39건, 흉막 삼출액 13건과 EBUS 7건에서 채취한 25개의 세포블록이 포함되었다(표 1). KRAS (25.4%), EGFR (18.2%), BRAF (6.3%), ERBB2 .......

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토론

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모든 단계의 진단 시 분자 변화 평가를 위한 반사 검사로서 초고속 앰플리콘 기반 NGS 접근법의 개발은 NS-NSCLC 5,22,23에서 지침에서 권장하는 모든 바이오마커 및 새로운 바이오마커를 검출하기 위한 최적의 옵션입니다. 순차적 방법(IHC, PCR, FISH)은 특정 유전자에만 초점을 맞추고 조직 물질 고갈을 초래할 수 있지만, 이 NGS 워크플로우는 적은 양의 핵산(본 연구에 따르면 각 DNA 및 RNA 염기서열분석에 대해 최소 13ng)으로도 돌연변이, 융합 및 증폭을 포함한 50개 유전자의 상태에 대한 특이적이고 민감한 평가를 가능하게 합니다.

또한 이 방법은 NS-NSCLC 환자 관리를 위한 빠르고 적절한 결과를 제공합니다. 맞춤형 접근법에 비해 종양 단계에 따라 분석할 사례를 초기에 선택할 필요가.......

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공개 사항

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Christophe Bontoux는 유료 연사 활동에 참여하고 Thermo Fisher Scientific의 혜택을 받습니다. Paul Hofman은 유료 연사 활동에 참여하며 Thermo Fisher Scientific으로부터 혜택과 자금을 지원받습니다.

감사의 글

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Thermo Fisher Scientific의 장치와 재료를 사용할 수 있는 기회를 제공해 주셔서 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96 웰 하드 쉘 플레이트 클리어Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
접착제 PCR 플레이트 호일Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M 튜브 Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A38738FFPE 시료 처리 튜브
Genexus 바코드 1-32 HDThermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A40261
Genexus GX5 칩 및 Genexus 커플러Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A40269
Genexus 피펫 팁Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A40266
Genexus 정제 기기Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A48148자동 정제 기기(API)
Genexus 염기서열분석 키트Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A40271
Genexus 템플릿 스트립 3-GX5 및 4Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A40263
Genexus 통합 시퀀서Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
이온 토렌트  Genexus FFPE DNA/RNA 정제 콤보 키트Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)A45539
Oncomine  정밀 분석 GX(OPA) 패널(스트립 1 및 2-HD 포함)Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)A46291

참고문헌

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  1. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  2. Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel t....

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재인쇄 및 허가

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