방법 논문

마우스 등쪽 뿌리 신경절 냉동 절제술을 위한 절차

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DOI:

10.3791/65232

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2023년 6월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 고품질의 등뿌리 신경절 냉동 유지 장치 절편을 지속적으로 획득하기 위한 개발입니다.

초록

고품질 마우스 배근 신경절(DRG) 냉동 유지 장치 절편은 염증성 및 신경병증성 통증, 가려움증 및 기타 말초 신경학적 상태 연구에서 적절한 면역화학 염색 및 RNAscope 연구에 매우 중요합니다. 그러나 DRG 조직의 샘플 크기가 작기 때문에 유리 슬라이드에서 고품질의 온전하고 평평한 저온 유지 장치 절편을 일관되게 얻는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 지금까지 DRG 동결 절제술을 위한 최적의 프로토콜을 설명하는 논문은 없습니다. 이 프로토콜은 DRG 동결 절제술과 관련하여 자주 발생하는 어려움을 해결하기 위한 단계별 방법을 제시합니다. 제시된 기사에서는 DRG 조직 샘플에서 주변 액체를 제거하고, DRG 섹션을 동일한 방향을 향하도록 슬라이드에 배치하고, 유리 슬라이드의 섹션을 구부리지 않고 평평하게 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 DRG 샘플의 냉동 절편을 위해 개발되었지만, 샘플 크기가 작은 다른 많은 조직의 냉동 절제에 적용할 수 있습니다.

서론

등뿌리신경절(dorsal root ganglion, DRG)은 일차 감각 뉴런, 조직 대식세포, 일차 감각 뉴런 1,2,3,4를 둘러싸고 있는 위성 세포를 포함합니다. 무해하고 유해한 신호를 처리하는 데 중요한 해부학적 구조이며 통증, 가려움증 및 다양한 말초 신경 장애 5,6,7,8,9,10,11,12,13에 중요한 역할을 합니다. 마우스 척수(14,15,16)로부터 DRG 조직을 해부하....

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프로토콜

본 연구의 경우 동물 실험은 UCSF Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었습니다. 성체, 8-12주 된 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(자체 사육)를 여기에 사용하였다.

1. DRG 시료 전처리

  1. 2.5% 아베르틴으로 마우스를 마취합니다(재료 표 참조). 고통스러운 자극에 대한 반응 부족으로 적절한 마취를 보장합니다. 앞서 기술한바와 같이 1x 인산염-완충 식염수(PBS)에 이어 4% 포름알데히드를 동물에 심 경관류한다 14,15,16.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 척수에서 DRG 조직을 절개합니다14,15,16.
  3. 해부된 DRG를 실온에....

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결과

이번 연구에서는 마우스 L4 DRG 한 마리에서 약 16개의 연속적인 고품질 DRG 절편을 수집했습니다. 얻어진 부분은 왜곡이 없었습니다. 그림 1 은 동결 절제술을 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 조직 절편에서 여분의 액체를 제거하는 방법은 그림 2에 나와 있습니다. 조직의 OCT 포매 과정은 그림 3에 강조되어 있습니다. 그림 4 는 유리 슬라이드에 DRG 섹션이 올바르게 배치된 것을 보여줍니다. 그림 5 는 마우스 DRG 절편의 생리학적 구조에 대한 컨포칼 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. Nissl 염색은 다양한 크기의 DRG 감각 뉴런을 보여주고, DAPI 염색은 뉴런을 둘러싼 세포를 보여줍니다. 이 이미지는 이 프로토콜로 .......

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토론

이 프로토콜은 마우스 DRG의 저온 유지 장치 절편을 위한 쉬운 단계별 절차를 제공하여 슬라이드에서 고품질 DRG 절편을 안정적으로 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 네 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, DRG 샘플을 기본 OCT에 넣기 전에 DRG 샘플과 핀셋을 건조시켜야 합니다. DRG 샘플을 둘러싼 모든 액체는 그 주위에 얼음 껍질을 형성하여 DRG 섹션이 OCT에서 분리되고 위로 구부러집니다. 둘째, 알루미늄 블록에 표시가 없거나 베이스 OCT가 마크를 덮는 경우 베이스 OCT의 하단(6시 위치)에 표시를 하고 프로세스 전반에 걸쳐 이 표시를 6시 위치에 유지하는 것이 중요합니다. 일정한 방향을 유지하면 DRG를 위에서 아래로 완전히 절단할 수 없고 일부 DRG 샘플이 누락되어 낭비되기 때문에 더 많은 DRG 섹션을 얻는 데 도움이 됩니다. 셋째, 베이스 OCT와 커버 OCT의 상단 가장자리는 알루미늄 블록의 상단 가장자리에 있어야 합니다. 이러한 방식으로 알루미늄 블록의 상단 가장자리는 유리 슬라이드가 DRG 섹션.......

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AvertinSigma-AldrichT48402-25G마취 동물
Epredia  극저온 투구 크라이오스탯 크라이오스탯, 25 mm dia. 크로스해치드피셔브랜드1910하단의 OCT 섹션을 잡아라 
Ergo 핀셋FisherbrandS95310핀셋 끝을 사용하여 바닥(6 o' clock)을 사용하여 섹션이 롤에서 뒤로 구부러지는 것을 방지하기 위해 플랫폼 표면에 달라붙
피셔브랜드  Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisherbrand1255015DRG 섹션을 수집하려면 
마킹 펜Fisherbrand133794  베이스 OCT Scigen의 방향 표시
  티슈-플러스 O.C.T. 컴파운드Fisherbrand  23730571최적의 절단 온도(O.C.T.)를 보장하기 위해 냉동 조직 표본을 위한 내장 배지.
도록 합니다.

참고문헌

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root gangl....

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재인쇄 및 허가

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태그

DRGDRGOCTRNAscope

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