방법 논문

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

DOI:

10.3791/65259

⸱

2023년 11월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 2Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 4VA Tennessee Valley Healthcare System

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.

초록

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랑게르한스의 췌장 섬은 췌장 전체에 산재된 특수 내분비 및 지원 세포의 작은 3D 집합체로, 혈당을 낮추는 베타 세포의 인슐린 분비와 혈당을 높이는 알파 세포의 글루카곤 분비를 통해 포도당 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. cAMP에 의해 매개되는 것을 포함한 세포 내 신호 전달 경로는 조절된 알파 및 베타 세포 호르몬 분비에 중요합니다. 3D 섬 구조는 조정된 섬 기능에 필수적이지만, 1차 인간 섬 세포의 세포 내 신호 전달 경로에 대한 기계론적 연구에 대한 실험적 과제를 제시합니다. 이러한 과제와 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 당뇨병이 없는 기증자로부터 생성된 1차 인간 유사섬을 사용하여 형태, 구성 및 기능에서 토착 섬과 유사한 통합 생세포 이미징 및 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이러한 pseudoislet은 1차 인간 islet 세포의 분산 및 재응집 과정을 통해 크기가 조절됩니다. 분산된 상태에서, 섬세포 유전자 발현은 조작될 수 있다; 예를 들어, 유전적으로 인코딩된 cAMP 바이오센서, cADDis와 같은 바이오센서가 도입될 수 있다. 일단 형성되면 공초점 현미경 및 미세 주변 융합 플랫폼과 함께 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 발현하는 유사섬을 통해 형광 바이오센서 역학과 알파 및 베타 세포 호르몬 분비 프로파일을 동시에 평가하여 세포 과정 및 기능에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

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랑게르한스 섬은 췌장 전체에 흩어져 있는 작은 기관으로, 그 기능은 포도당 항상성 유지에 매우 중요합니다. 인슐린은 포도당의 대사, ATP/ADP 비율의 증가, ATP에 민감한 칼륨 채널의 폐쇄, 원형질막의 탈분극, 세포외 칼슘의 유입에 따라 베타 세포에서 분비됩니다1. 알파 세포에서 글루카곤 분비는 잘 알려져 있지 않지만, 세포 내 및 파라크린 경로가 글루카곤 과립 엑소사이토시스 2,3,4에 기여하는 것으로 추정되었습니다. 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병은 모두 섬세포 기능 장애와 관련이 있다 5,6,7. 따라서 섬 호르몬 분비를 매개하는 세포 내 신호 전달 경로를 규명하는 것은 췌장 섬의 생리학적 및 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

섬의 구형 구조는 실험에 특정 장애물을 제시합니다. 이러한 문제에는 섬의 크기 변화와 섬의 3D 특성이 포함되며, 이는 섬 ....

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프로토콜

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인간 섬(N=4 제제)은 Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. 및 Imagine Pharma와의 파트너십을 통해 획득되었습니다. 밴더빌트 대학교 기관 검토 위원회(Vanderbilt University Institutional Review Board)는 비식별화된 인간 췌장 표본을 인간 피험자 연구로 간주하지 않습니다. 이 작업은 장기 기증자와 그 가족, 장기 조달 기관이 없었다면 불가능했을 것입니다. 기증자 인구 통계 정보는 표 1 을 참조하십시오. 당뇨병이 없는 췌장 기증자의 인간 섬은 15시간 미만의 저온 허혈 시간으로 분리되었습니다.

1. 가도섬(Pseudoislet) 형성 (Walker et al.7)

  1. P200 피펫 및 탁상용 현미경을 사용하여 1차 인간 섬을 채취하고 직접 선택하며, 섬 배양 배지(CMRL 1066의 10% FBS, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100U/mL 페니실린, 2mM L-글루타민) 외부의 표면에서 피펫 팁을 오염시키지 않....

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결과

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바이오센서-발현 인간 유사섬은 cAMP 바이오센서 cADDis를 암호화하는 작제물의 아데노바이러스 전달을 통해 생성되었다(도 1A). 그림 1B는 시간 경과에 따른 형질도입된 인간 섬세포의 재응집을 보여주며, 배양 6일 후 완전히 형성된 유사섬이 관찰되었습니다. 세포는 48시간 이내에 가시적인 cADDis 형광을 나타내기 시작했으며, 배양 기간이 끝날 무렵에는 형질도입된 세포에서 높은 바이오센서 발현이 있었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 pseudoislet은 알파 세포에서 60%, 베타 세포에서 95%의 평균 형질도입 효율을 나타냈습니다(그림 1C-D).

통합된 미세유체 및 라이브 셀 이미징 플랫폼은 그림 2에 강조 표시.......

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토론

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미세 주위 융합 시스템, 바이오센서 발현 유사섬 및 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 통합으로 세포 내 신호 이벤트 및 동적 호르몬 분비 프로파일의 동시 평가가 가능합니다. 동적 미세페리퓨전 시스템은 유사섬에 일련의 잘 정의된 자극을 전달할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 ELISA로 인슐린 및 글루카곤 농도를 측정할 수 있는 폐수 수집을 허용합니다. 동시에, 컨포칼 현미경 플랫폼에 의한 바이오센서 발현 유사섬의 살아있는 세포 이미징은 세포 내 신호 이벤트에 대한 정보를 제공하는 실시간 바이오센서 형광 활동을 캡처합니다. 시간 경과에 따른 바이오센서 신호와 호르몬 분비 프로파일의 동시 측정은 섬 호르몬 분비에 대한 세포 내 신호 전달 사건의 영향을 직접 비교할 수 있는 기회를 제공합니다.

여러 가지 고려 사항이 제시된 프로토콜의 성공의 열쇠입니다. 여기에는 바이오센서 발현 유사섬을 생성하고 유사섬 이동 없이 각 실험 동안 일정한 유속을 사용하는 것이 포함됩니다. 100μL/min의.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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장기 기증자와 그 가족들은 귀중한 기증에 감사하고 있으며, 국제장기조달기구협회(IIAM)와 국립질병연구거래소(NDRI)는 인간의 췌장 조직을 연구에 활용할 수 있도록 협력한 공로를 인정받고 있습니다. 이 연구는 Human Islet Research Network(RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program(RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 및 DK20593(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, 미국 재향군인회(BX000666)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십(1937963)의 NIGMS.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ad-CMV-cADDisWelgen해당 없음
  0.01인치 FEP 튜빙IDEX1527L
1 M HEPESGibco15630-080Enriched-CMRL 매체 구성 요소
1.5 mL 및 원추형 튜브임의의
10 μ m PTFE 필터Cole-ParmerSK-21940-418-10회마다 교체
100mM 피루브산 나트륨Thermo Scientific11360070 Enriched-CMRL 배지 구성 요소
190 프루프 에탄올Decon labs2816산성 에탄올 구성
요소 200mM GlutaMAX-I 보충제Gibco35050061Enriched-CMRL 미디어 구성 요소
AscorbateSigmaA5960DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소
소 혈청 알부민시그마A7888DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소
버블 트랩 Omnifit006BT
CellCarrier ULA  96웰 마이크로플레이트Perkin Elmer6055330
cellSens 분석 소프트웨어Olympusv3.1데이터 분석에 사용되는 소프트웨어
CMRL 1066MediaTech 15-110-CVEnriched-CMRL 미디어 구성 요소
원뿔형 어댑터 (IDEX, P-794)IDEXP-794
D-(+)-글루코스시그마G7528글루코스 버퍼 컴포넌트
DMEM SigmaD5030DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamberokolabIX83
Epinepherine (Epi)SigmaE4250Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedSigma12306CEnriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISAMercodia10-1281-01
글루카곤 키트 HTRFCisbio62CGLPEH
HCl (12N)모든산 에탄올 구성 요소
HEPES시그마H7523DMEM Perifusion 버퍼 구성 요소
iCell 내피 세포 매체 보충제세포 역학M1019iEC 미디어 구성 요소
Idex Derlin 너트 및 페룰 1 / 4-24Cole-ParmerEW-00414-LW
인슐린 ELISAMercodia10-1113-01
이소 부틸 메틸 로닌 (IBMX)시그마I5879자극 완충 장치 구성 요소
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경올림푸스FV3000
L-글루타민시그마G8540DMEM 페리 퓨전 버퍼 구성 요소
마이크로 칩 (마이애미 대학교, FP-3W)마이애미대학교FP-3W
마이크로칩 홀더 Micronit MicrofluidicsFC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction CollectorBiorad7318122
P10, P200, P1000 피펫 및 팁어떤어떤 페
니실린/스트렙토마이신Gibco15140-122Enriched-CMRL 미디어 컴포넌트
연동 펌프 InstechP720
인산염 완충 식염수Gibco14190-144세척 섬
Sarstedt 접시접시 직경
. 중탄산 나트륨시그마S6014DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소
피루브산 나트륨시그마P2256  DMEM Perifusion Buffer Component
StereoscopeOlympusSZX12
Steriflip Filter (0.22 μ m)MilliporeSCGP00525모든 버퍼를 두 번 필터링
VascuLife VEGF 매체 전체 키트LifeLine Cell TechnologyLL-0003iEC 매체 구성 요소
는 에 따라 다릅니다

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alph....

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태그

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