이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
랑게르한스의 췌장 섬은 췌장 전체에 산재된 특수 내분비 및 지원 세포의 작은 3D 집합체로, 혈당을 낮추는 베타 세포의 인슐린 분비와 혈당을 높이는 알파 세포의 글루카곤 분비를 통해 포도당 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. cAMP에 의해 매개되는 것을 포함한 세포 내 신호 전달 경로는 조절된 알파 및 베타 세포 호르몬 분비에 중요합니다. 3D 섬 구조는 조정된 섬 기능에 필수적이지만, 1차 인간 섬 세포의 세포 내 신호 전달 경로에 대한 기계론적 연구에 대한 실험적 과제를 제시합니다. 이러한 과제와 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 당뇨병이 없는 기증자로부터 생성된 1차 인간 유사섬을 사용하여 형태, 구성 및 기능에서 토착 섬과 유사한 통합 생세포 이미징 및 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이러한 pseudoislet은 1차 인간 islet 세포의 분산 및 재응집 과정을 통해 크기가 조절됩니다. 분산된 상태에서, 섬세포 유전자 발현은 조작될 수 있다; 예를 들어, 유전적으로 인코딩된 cAMP 바이오센서, cADDis와 같은 바이오센서가 도입될 수 있다. 일단 형성되면 공초점 현미경 및 미세 주변 융합 플랫폼과 함께 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 발현하는 유사섬을 통해 형광 바이오센서 역학과 알파 및 베타 세포 호르몬 분비 프로파일을 동시에 평가하여 세포 과정 및 기능에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다.
서론
랑게르한스 섬은 췌장 전체에 흩어져 있는 작은 기관으로, 그 기능은 포도당 항상성 유지에 매우 중요합니다. 인슐린은 포도당의 대사, ATP/ADP 비율의 증가, ATP에 민감한 칼륨 채널의 폐쇄, 원형질막의 탈분극, 세포외 칼슘의 유입에 따라 베타 세포에서 분비됩니다1. 알파 세포에서 글루카곤 분비는 잘 알려져 있지 않지만, 세포 내 및 파라크린 경로가 글루카곤 과립 엑소사이토시스 2,3,4에 기여하는 것으로 추정되었습니다. 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병은 모두 섬세포 기능 장애와 관련이 있다 5,6,7. 따라서 섬 호르몬 분비를 매개하는 세포 내 신호 전달 경로를 규명하는 것은 췌장 섬의 생리학적 및 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
섬의 구형 구조는 실험에 특정 장애물을 제시합니다. 이러한 문제에는 섬의 크기 변화와 섬의 3D 특성이 포함되며, 이는 섬 ....
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프로토콜
인간 섬(N=4 제제)은 Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. 및 Imagine Pharma와의 파트너십을 통해 획득되었습니다. 밴더빌트 대학교 기관 검토 위원회(Vanderbilt University Institutional Review Board)는 비식별화된 인간 췌장 표본을 인간 피험자 연구로 간주하지 않습니다. 이 작업은 장기 기증자와 그 가족, 장기 조달 기관이 없었다면 불가능했을 것입니다. 기증자 인구 통계 정보는 표 1 을 참조하십시오. 당뇨병이 없는 췌장 기증자의 인간 섬은 15시간 미만의 저온 허혈 시간으로 분리되었습니다.
1. 가도섬(Pseudoislet) 형성 (Walker et al.7)
- P200 피펫 및 탁상용 현미경을 사용하여 1차 인간 섬을 채취하고 직접 선택하며, 섬 배양 배지(CMRL 1066의 10% FBS, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100U/mL 페니실린, 2mM L-글루타민) 외부의 표면에서 피펫 팁을 오염시키지 않....
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결과
바이오센서-발현 인간 유사섬은 cAMP 바이오센서 cADDis를 암호화하는 작제물의 아데노바이러스 전달을 통해 생성되었다(도 1A). 그림 1B는 시간 경과에 따른 형질도입된 인간 섬세포의 재응집을 보여주며, 배양 6일 후 완전히 형성된 유사섬이 관찰되었습니다. 세포는 48시간 이내에 가시적인 cADDis 형광을 나타내기 시작했으며, 배양 기간이 끝날 무렵에는 형질도입된 세포에서 높은 바이오센서 발현이 있었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 pseudoislet은 알파 세포에서 60%, 베타 세포에서 95%의 평균 형질도입 효율을 나타냈습니다(그림 1C-D).
통합된 미세유체 및 라이브 셀 이미징 플랫폼은 그림 2에 강조 표시.......
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토론
미세 주위 융합 시스템, 바이오센서 발현 유사섬 및 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 통합으로 세포 내 신호 이벤트 및 동적 호르몬 분비 프로파일의 동시 평가가 가능합니다. 동적 미세페리퓨전 시스템은 유사섬에 일련의 잘 정의된 자극을 전달할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 ELISA로 인슐린 및 글루카곤 농도를 측정할 수 있는 폐수 수집을 허용합니다. 동시에, 컨포칼 현미경 플랫폼에 의한 바이오센서 발현 유사섬의 살아있는 세포 이미징은 세포 내 신호 이벤트에 대한 정보를 제공하는 실시간 바이오센서 형광 활동을 캡처합니다. 시간 경과에 따른 바이오센서 신호와 호르몬 분비 프로파일의 동시 측정은 섬 호르몬 분비에 대한 세포 내 신호 전달 사건의 영향을 직접 비교할 수 있는 기회를 제공합니다.
여러 가지 고려 사항이 제시된 프로토콜의 성공의 열쇠입니다. 여기에는 바이오센서 발현 유사섬을 생성하고 유사섬 이동 없이 각 실험 동안 일정한 유속을 사용하는 것이 포함됩니다. 100μL/min의.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
장기 기증자와 그 가족들은 귀중한 기증에 감사하고 있으며, 국제장기조달기구협회(IIAM)와 국립질병연구거래소(NDRI)는 인간의 췌장 조직을 연구에 활용할 수 있도록 협력한 공로를 인정받고 있습니다. 이 연구는 Human Islet Research Network(RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program(RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 및 DK20593(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, 미국 재향군인회(BX000666)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십(1937963)의 NIGMS.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | 해당 없음 | |
| 0.01인치 FEP 튜빙 | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL 매체 구성 요소 |
| 1.5 mL 및 원추형 튜브 | 임의의 | ||
| 10 μ m PTFE 필터 | Cole-Parmer | SK-21940-41 | 8-10회마다 교체 |
| 100mM 피루브산 나트륨 | Thermo Scientific | 11360070 Enriched-CMRL 배지 구성 요소 | |
| 190 프루프 에탄올 | Decon labs | 2816 | 산성 에탄올 구성 |
| 요소 200mM GlutaMAX-I 보충제 | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL 미디어 구성 요소 |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소 |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A7888 | DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소 |
| 버블 트랩 | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96웰 마이크로플레이트 | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens 분석 소프트웨어 | Olympus | v3.1 | 데이터 분석에 사용되는 소프트웨어 |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL 미디어 구성 요소 |
| 원뿔형 어댑터 (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-글루코스 | 시그마 | G7528 | 글루코스 버퍼 컴포넌트 |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| 글루카곤 키트 HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | 모든 | 산 에탄올 구성 요소 | |
| HEPES | 시그마 | H7523 | DMEM Perifusion 버퍼 구성 요소 |
| iCell 내피 세포 매체 보충제 | 세포 역학 | M1019 | iEC 미디어 구성 요소 |
| Idex Derlin 너트 및 페룰 1 / 4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| 인슐린 ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| 이소 부틸 메틸 로닌 (IBMX) | 시그마 | I5879 | 자극 완충 장치 구성 요소 |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | 올림푸스 | FV3000 | |
| L-글루타민 | 시그마 | G8540 | DMEM 페리 퓨전 버퍼 구성 요소 |
| 마이크로 칩 (마이애미 대학교, FP-3W) | 마이애미 | 대학교FP-3W | |
| 마이크로칩 홀더 | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
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| 니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL 미디어 컴포넌트 |
| 연동 펌프 | Instech | P720 | |
| 인산염 완충 식염수 | Gibco | 14190-144 | 세척 섬 |
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| VascuLife VEGF 매체 전체 키트 | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC 매체 구성 요소 |
참고문헌
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alph....
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