지역별 탈세포화된 폐 조직의 해부 및 분리

요약

여기에 제시된 것은 국소 탈세포화된 폐 조직의 분리를 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포외 기질 및 세포-기질 상호 작용의 복잡성을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

초록

폐 이식은 종종 중증 폐 질환의 후기 단계에 있는 환자에게 유일한 옵션이지만 적절한 기증자 폐의 공급과 이식 후 급성 및 만성 거부 반응으로 인해 제한적입니다. 병든 폐를 대체하기 위한 새로운 생명공학적 접근법을 확인하는 것은 환자 생존율을 개선하고 현재 이식 방법론과 관련된 합병증을 피하는 데 필수적입니다. 대안적인 접근법은 일반적으로 급성 및 만성 거부 반응의 원인인 세포 성분이 결여된 탈세포화된 전체 폐를 사용하는 것입니다. 폐는 매우 복잡한 기관이기 때문에 혈관계, 기도 및 폐포 조직을 포함한 특정 영역의 세포외 기질 성분을 검사하는 것이 중요합니다. 이 접근법의 목적은 연구자들이 완전히 탈세포화된 폐에서 지역별 조직을 해부하고 분리할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 확립하는 것입니다. 현재 프로토콜은 돼지와 인간의 폐를 위해 고안되었지만 다른 종에도 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 조직의 4개 영역(기도, 혈관계, 폐포 및 벌크 폐 조직)을 지정했습니다. 이 절차를 통해 기존의 대량 분석 방법과 달리 탈세포화된 폐 조직의 내용물을 보다 정확하게 나타내는 조직 샘플을 조달할 수 있습니다.

서론

만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 특발성 폐섬유증(IPF) 및 낭포성 섬유증(CF)을 포함한 폐질환은 현재 치료법이 없는 상태로 남아 있다 1,2,3,4. 폐 이식은 종종 후기 단계의 환자에게 유일한 옵션이지만, 적절한 기증자 폐의 공급과 이식 후 급성 및 만성 거부 반응으로 인해 제한된 옵션으로 남아 있습니다 ^3,5,6. 따라서 새로운 치료 전략이 절실히 필요합니다. 호흡기 생명 공학에서 한 가지 유망한 접근 방식은 탈세포화된 천연 폐 조직에서 제조된 조직 유래 스캐폴드의 적용입니다. 무세포 전체 폐 스캐폴드는 천연 세포외 기질(ECM) 조성 및 생체 활성의 복잡성을 많이 유지하므로 전체 장기 공학 및 폐 질환 메커니즘^연구를 위한 개선된 모델로 집중적으로 연구되었습니다 ^7,8,9,10

프로토콜

모든 동물 연구는 버몬트 대학교(UVM)의 IACUC에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 폐는 UVM 부검 서비스에서 획득했으며 관련 연구는 UVM의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 돼지 및 인간 폐의 탈세포화는 이전에 우리 그룹 7,8,9,10,21에 의해 설명되었습니다. 간단히 말해서, 전체 폐엽은 연동 펌프를 사용하여 일련의 2L 세제 및 효소 용액으로 기도 및 맥관 구조의 순차적 관류를 통해 탈세포화됩니다: 0.1% Triton-X 100, 2% 나트륨 데옥시콜레이트, 1M 염화나트륨, 30μg/mL DNase/1.3mM MgSO 4/2mM CaCl₂, 0.1% 과초산/₄% 에탄올, 및 탈이온수 세척을 포함한다. 효율적인 탈세포화를 확인하기 위한 표준 방법에는 탈세포화된 폐 내에서 <50ng/mg의 잔류 이중 가닥 DNA 측정과 겔 전기영동에 의한 DNA 단편의 부재, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)....

결과

프로토콜의 전체 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 일단 숙달되면 탈세포화된 폐 조직의 국소 해부를 쉽게 재현할 수 있습니다. 절단된 각 조직 샘플의 분류를 결정하는 것은 해부 절차의 성공에 필수적입니다. 혈관 조직은 기도보다 훨씬 더 탄력적이므로 집게를 사용하여 조직을 늘리는 것은 종종 특정 샘플이 혈관 구조인지 기도인지에 대한 강력한 지표입니다. 전형적으로, 혈관 조직은 기도와 평행하게 움직인다(도 2A). 혈관 조직은 또한 기도 조직(그림 2C)보다 색이 더 하얗고 불투명하게 나타나는 경향이 있습니다(그림 2B). 프로토콜에 설명된 수술용 가위 살포 기술은 그림 3에 나와 있습니다. 기도의 더 큰 샘플은 기도 자체보다 약간 더 하얗게 보이는 연골 고리로 둘러싸.......

토론

인간 및 다른 종의 탈세포화된 조직은 3D 하이드로겔을 포함한 생체 외 배양 모델에서 ECM 구성 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 생체 재료로 자주 활용됩니다^12,13. 다른 기관과 유사하게, 탈세포화된 폐는 이전에 건강한 폐와 병든(즉, 폐기종 및 IPF) 폐의 ECM 구성 차이를 결정하는 데 사용되었으며 ECM 역학 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 하이드로겔로 점점 더 많이 활용 되고 있습니다 7,8,9,10,11,14,15,16,17

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
본 가위	파인 사이	14184-09
Dumont #5 - 파인 펜치	파인 사이언스 툴	11254-02
펜치, 곡선형, S/s, 무딘, 톱니 - 130mm	CellPath	N/A
경화 파인 사이언스	툴	14090-11
Moria Iris 펜치	파인 사이언스 도구	11373-22
파이렉스 유리 캐서롤 접시	콜 파머	3175-10

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