여기에서, 자유형 접근법(즉, 입체적 장치 없이)을 사용하여 마우스에서 뇌내주사를 수행하기 위한 간단하고 신속한 접근법이 설명된다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 내분비계를 조사하려면 종종 약물, 바이러스 또는 기타 실험 물질을 쥐의 뇌에 직접 전달해야 합니다. 뇌내 심실(ICV) 주사는 뇌 전체(특히 심실 근처의 구조)에 실험 물질을 광범위하게 전달할 수 있습니다. 여기에서, 성체 마우스에서 프리-핸드 ICV 주사를 하는 방법을 설명한다. 쥐의 머리에 시각 및 촉각 랜드마크를 사용하여 측실에 빠르고 안정적으로 주입할 수 있습니다. 주사는 실험자의 손에 들린 유리 주사기로 이루어지며 랜드마크에서 대략적인 거리에 배치됩니다. 따라서 이 기술에는 입체 프레임 이 필요하지 않습니다. 또한, 이 기술은 잠깐의 이소플루란 마취만을 필요로 하며, 이는 깨어 있고 자유롭게 행동하는 마우스에서 마우스 행동 및/또는 생리학의 후속 평가를 허용합니다. 자유형 ICV 주사는 살아있는 쥐의 뇌에 실험 물질을 효율적으로 전달하기 위한 강력한 도구이며 빈번한 혈액 샘플링, 신경 회로 조작 또는 신경 내분비 과정을 조사하기 위한 생체 내 기록과 같은 다른 기술과 결합할 수 있습니다.
서론
약물1, 바이러스2 또는 세포3와 같은 실험 물질의 뇌 전달은 종종 신경내분비 연구에 필요하다. 약제가 혈액뇌장벽을 쉽게 통과하지 못하거나 실험 목적이 약제의 중심 효과를 구체적으로 테스트하는 것이라면 뇌에 주사를 전달하는 신뢰할 수 있는 방법을 갖는 것이 중요합니다. 또한, 뇌내(ICV) 공간으로의 주입은 약제를 뇌에 널리 분포시킬 수 있는 기회를 제공하고 넓은 표적 영역을 제공하므로 성공적인 주입 가능성을 높인다2.
ICV 주사를 만드는 일반적인 방법에는 영구 유치 캐뉼라를 배치하는 것이 포함됩니다. 이 접근법에서, 캐뉼라가 제자리에 접착되거나 접합되기 때문에, 상업적으로 이용 가능한 또는 주문형 캐뉼라를 배치하기 위해 입체 프레임 (stereotaxic frame)이 필요하다. 종종 회복 시 안지오텐신 II의 초생리학적 용량이 캐뉼라를 통해 투여되며, 음주 행동이 즉시 관찰되면 캐뉼라가 올바르게 배치된 것으로 간주된다4. 이 접근 방식은 장기 주입을 수행할 수 있는 능력과 동일한 동물을 여러 번 주입할 수 있는 능력을 포함하여 많은 장점이 있습니다. 또한, 안지오텐신 II를 사용하는 경우, 실험 화합물을 투여하기 전에 올바른 배치를 확인할 수 있습니다. 그러나 영구 캐뉼라를 배치하는 데에는 고가의 장비(입체 프레임)에 대한 요구 사항, 배치 후 캐뉼라가 손상될 가능성(예: 쥐가 케이지 메이트의 캐뉼라를 씹을 수 있음) 및 영구 캐뉼라 주변의 감염 가능성을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 단일 ICV 주사는 입체탁스 프레임(stereotaxic frame)3을 사용하여 이루어질 수 있는데, 이는 효과적이기는 하지만, 마취에 대한 상당한 노출을 필요로 하며, 따라서 치료의 일부 급성 생리학적 및 행동적 효과를 모호하게 할 수 있다. 또한, 입체 프레임에 마우스를 배치하려면 안정적인 배치를 달성하고 외이도의 파열을 방지하기 위해 상당한 훈련이 필요합니다.
여기에서, 마우스에서 프리-핸드 주사를 하기 위한 확립된 방법이 설명된다. 이 방법은 이전 보고서 5,6을 기반으로 합니다. 이 기술의 장점은 간단하고 빠르며 입체 프레임과 같은 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 후술하는 바와 같이, 이 시술은 주사를 만들기 위해 마우스 헤드의 랜드마크에 대해 유리 주사기를 조작하는 것을 포함하며, 이는 신속하게 수행될 수 있으므로 실험 당일에 몇 분의 가스 마취만 필요합니다.
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프로토콜
모든 절차는 콜로라도 주립 대학(#3960)과 캘리포니아 대학 샌디에이고 기관 동물 관리 및 사용 위원회(S13235, PI Kellie Breen Church)의 승인을 받았습니다. 5마리의 성체 암컷과 2마리의 성체 수컷 C57/BL6 마우스(9-16주령)의 데이터가 대표 데이터 섹션에 묘사되어 있습니다. 암컷 마우스는 앞서 기술한 바와 같이 ICV 주사 및 채혈 3-4주 전에 난소 절제술을 하였다7. 실험 전에 이 쥐는 12시간 빛/12시간 어두운 빛 주기로 수용되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 사료와 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.
1. 개두술 시행
참고: 개두술은 실제 주사 하루 이상 전에 시행할 수 있으므로 실험 당일에 주입 과정이 더 빨라집니다.
- 아래에 설명된 대로 개두술을 위한 재료를 준비합니다.
- 작업 표면에 깨끗한 벤치 패드나 드레이프 재료를 놓습니다. 이소플루란 기화기의 노즈 콘을 작업 표면에 테이프로 붙입니다(실험자와 가깝지만 반대쪽을 향함, 그림 1A 참조).
- 멸균 된 날카로운 18G 바늘 끝에 실라스틱 튜브를 놓아 바늘 끝의 ~ 1mm가 튀어 나오도록합니다. 멸균 뭉툭한 바늘 끝에 실라스틱 튜브를 놓아 바늘 끝의 ~1mm가 튀어나오도록 합니다.
알림: 각 마우스에는 별도의 멸균 사전 포장된 바늘(날카롭고 뭉툭한 바늘)을 사용해야 합니다. - 전기 면도기, 요오드 스크럽, 멸균 거즈, 알코올 패드를 모아 주사 부위를 준비합니다.
- 아래 설명과 같이 바늘을 옆으로 2mm, 꼬리로 1mm 움직이는 연습을 합니다.
- 눈금자와 펜을 사용하여 시작점(브레그마), 왼쪽 또는 오른쪽으로 2mm 표시, 마지막 표시에서 1mm 위에 다른 표시(주입 부위, 그림 1B 참조)를 종이에 표시합니다.
- 바늘을 시작점에서 표시점 1, 표시점 2(브레그마에서 주입 부위까지)로 가이드 없이 이동이 반복될 수 있을 때까지 연습합니다.
참고: 여기에 설명된 좌표는 성인 C57/BL6 마우스에 효과적이지만 다른 균주 또는 연령 그룹은 조정이 필요할 수 있습니다.
- 아래 설명된 대로 개두술을 위해 마우스를 준비합니다.
- 마우스를 유도 챔버에 넣고 의료용 산소에 3%-4% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 시술에 익숙해지고 연습하면 개두술 시술을 위해 이소플루란 노출의 총 지속 시간을 10분 미만으로 줄이십시오.
주의 : 이소플루란 노출은 인체 건강에 해롭습니다. 폐가스를 청소하는 수단으로 환기가 잘 되는 곳에서 승인되고 검사된 이소플루란 기화기를 사용하십시오. - 발가락 반사가 없으면 동물의 머리를 면도하십시오. 눈 윤활제를 바르십시오.
- 마취를 유지하기 위해 머리를 노즈콘에 대고 마우스를 작업 표면에 놓습니다.
- 공급자의 지시에 따라 부프레노르핀(0.6-0.8mg/kg 마우스 체중, 피하)과 같은 진통제를 투여합니다.
- 요오드 용액에 적신 멸균 거즈로 헤드를 닦고(3회 문지르기) 알코올 스크럽 패드로 닦기(3회 수행)하여 주사 부위를 청소합니다.
알림: 털을 제거하고 주사 부위 주변의 피부를 청소하고 감염 예방을 위해 미국 수의학 협회에서 권장하는 대로 멸균 기구와 바늘을 사용하십시오.
- 마우스를 유도 챔버에 넣고 의료용 산소에 3%-4% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 시술에 익숙해지고 연습하면 개두술 시술을 위해 이소플루란 노출의 총 지속 시간을 10분 미만으로 줄이십시오.
- 자주 사용하지 않는 손으로 마우스의 머리를 단단히 잡습니다. 헤드를 작업 표면에 가능한 한 평평하게 놓으십시오.
- 주사 부위를 찾습니다.
- 준비된 날카로운 18G 바늘을 사용하여 먼저 브레그마를 식별하십시오. 이를 위해 정중선을 따라 머리 피부를 가로질러 바늘을 드래그하여 로스트랄-꼬리 평면에서 움직입니다. 두 꼭짓점이 눈이고 세 번째 꼭짓점이 브레그마의 대략적인 위치인 정삼각형을 상상해 보십시오( 그림 1C 참조).
- 브레그마에서 바늘을 측면 2mm, 꼬리 1mm를 주사 부위로 이동합니다.
- 바늘을 수직으로 잡은 상태에서 튜브가 피부와 같은 높이가 될 때까지 바늘을 피부와 뼈를 통해 단단히 밀어 넣습니다.
- 바늘을 집어넣고 바늘을 돌려 피부와 뼈를 다시 누릅니다. 뼈에 작은 구멍이 생길 때까지 이 과정을 반복합니다.
- 뭉툭한 바늘을 사용하여 뼈에 충분한 구멍이 생겼는지 확인합니다. 뭉툭한 바늘이 통과할 수 있을 만큼 뼈에 구멍을 뚫는 것을 목표로 합니다.
- 노즈콘에서 마우스를 제거하고 멸균 거즈로 주사 부위의 피를 닦아낸 다음 깨어날 때까지 케이지 워머의 케이지에 마우스를 넣습니다. 개두술로 만든 구멍이 작기 때문에(18G 바늘) 봉합사나 상처 클립으로 해당 부위를 닫을 필요가 없습니다.
참고: 여기에서 생산되는 개구부는 작기 때문에(18G) 많은 기관에서 이 절차를 수술이 아닌 주사로 간주합니다. 더욱이, 피부와 뼈를 통해 뇌로 통하는 구멍이 뚫려 있기는 하지만, 피부를 팽팽하게 유지하면 구멍이 정렬되지 않게 되는데, 이는 피부의 세균총이나 케이지 침구가 뇌에 닿는 것을 막는 데 도움이 될 수 있습니다.
2. 주사 만들기
- 아래 설명에 따라 주입 재료를 준비합니다.
- 작업 표면에 깨끗한 벤치 패드나 드레이프 재료를 놓습니다. 이소플루란 기화기의 노즈 콘을 작업 표면에 테이프로 붙입니다(실험자와 가깝지만 반대쪽을 향함, 그림 1A 참조).
- 45° 경사가 있는 10mm 길이의 27G 바늘을 5μL 유리 주사기에 부착합니다. 바늘 끝의 3.5mm가 돌출되도록 바늘에 실라스틱 튜브를 놓습니다. 실험실 테이프를 사용하여 튜브를 주사기 본체에 고정합니다( 그림 1D 참조).
- 튜브에 주입 매체(약물, 바이러스 또는 기타 주입용 액체)를 준비합니다. 본 연구의 대표 결과로는 멸균 등장성 식염수를 주입하였다.
알림: 2mL 미세 원심분리 튜브와 같이 유리 주사기와 바늘로 접근할 수 있는 튜브를 선택하십시오. - 유리 주사기에 주입 매체 3μL를 그립니다. 먼저 원하는 부피 이상을 뽑고 주사기에 3μL가 남을 때까지 배출합니다.
- 주사 부위를 준비하기 위해 요오드 스크럽, 멸균 거즈 및 알코올 패드를 모으십시오.
- 카운트업 모드에서 실험실 타이머를 시작하고 주입하는 동안 실험자가 볼 수 있도록 타이머를 배치합니다.
- 전날에 수행한 것처럼 바늘을 옆으로 2mm, 꼬리로 1mm 움직이는 연습을 합니다.
- 아래 설명에 따라 주입할 마우스를 준비합니다.
- 마우스를 유도 챔버에 넣고 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 발가락 반사가 없으면 눈 윤활제를 바르고 머리가 코뿔에 있는 상태에서 마우스를 작업 표면에 놓습니다.
- 요오드와 알코올을 각각 3 개의 물티슈로 주사 부위를 청소하십시오. 1.8단계에서 설명한 대로 18G 바늘(또는 무딘 바늘)로 주사 부위를 식별합니다. 개두술 중에 생긴 구멍은 감지할 수 있어야 합니다.
참고: 개두술을 미리 시행하지 않았거나 두개골의 구멍이 감지되지 않는 경우 여기에서 개두술을 수행할 수 있습니다.
- 아래 설명에 따라 유리 주사기로 주입을 수행합니다.
- 자주 사용하지 않는 손으로 마우스의 머리를 단단히 잡습니다. 헤드를 작업 표면에 가능한 한 평평하게 놓으십시오.
- 2.1.2단계에서 준비한 바늘 위에 놓인 튜브가 마우스의 피부에 놓일 때까지 유리 주사기의 바늘을 두개골의 구멍을 통해 놓습니다.
- 주사기를 가능한 한 수직으로 잡고 관상면과 시상면 모두에 주의를 기울입니다. 1분에 걸쳐 미디어를 천천히 주입합니다.
- 역류를 최소화하기 위해 주사 완료 후 주사기와 바늘을 1분 더 제자리에 고정합니다. 마우스 머리에서 바늘을 천천히 집어넣습니다.
- 콧방울에서 마우스를 제거하고 멸균 거즈(있는 경우)로 주사 부위의 혈액을 닦아내고 깨어날 때까지 케이지 워머의 케이지에 마우스를 넣습니다.
3. 사출 주입점 확인
- 앞서 설명한 바와 같이 인산염 완충 식염수(PBS)에 식염수와 4% 파라포름알데히드로 마우스를 깊이 마취하고 관류합니다8. 뇌가 가라앉을 때까지(일반적으로 2일) 4°C의 PBS에서 30% 자당에 뇌를 보관합니다.
- 앞에서 설명한 대로 저온 유지 장치에서 20-50μm 관상 절편을 절단합니다9. 절편하는 동안 조직 블록의 주입관을 관찰합니다. 주사관이 외측 심실과 명확하게 교차하는지 기록하십시오.
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결과
성공적으로 수행되면 이 기술은 실험 제제를 심실 시스템에 신속하게 전달할 수 있습니다. 많은 약리학적 화합물의 매개체인 멸균 등장성 식염수 3μL의 ICV 주사를 받은 난소 절제술 마우스의 황체 형성 호르몬(LH) 펄스 프로파일이 그림 2A에 나와 있습니다. 이 예는 가스 마취에 잠깐 노출되고 심실계에 3μL의 유체를 주입하는 것만으로는 박동성 LH 분비가 변하지 않는다는 것을 보여줍니다. ICV 주사 후 3시간에, 동물을 안락사시키고, 신선하게 냉동된 신경 조직을 채취하여 저온 유지 장치에서 절단하였다. 주사관은 외측 심실과 명확하게 교차했습니다. 주사관은 고정제(10mL의 헤파린화 식염수와 인산염 완충액의 4% 파라포름알데히드 20mL)를 관류한 마우스의 신경 조직에서도 볼 수 있었습니다. 올바르게 배치된 주입의 예가 그림 2B에 나와 있습니다. 잘못 배치된 주입의 두 가지 예가 그...
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토론
여기에서, 마우스에서 ICV 주사를 만들기 위한 간단하고 효과적인 수단이 설명된다. 이 기술은 입체 구조를 필요로 하지 않기 때문에 약물 및 실험 제제의 중앙 전달을 위한 이 접근 방식은 더 많은 연구자가 접근할 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 준비 및 주입 절차를 신속하게 수행할 수 있기 때문에 처리량이 상대적으로 높습니다.
이 시술은 대략적인 거리를 사용하여 바늘과 유리 주사기를 손으로 조작해야 하기 때문에 새로운 시술자는 살아있는 동물로 작업하기 전에 동작을 연습하는 데 시간을 할애하는 것이 좋습니다. 또한 쥐 시체는 바늘로 브레그마를 식별하는 연습을 하는 데 유용할 수 있습니다. 움직임에 대한 자신감이 생기면 헌신적인 살아있는 연습 동물과의 경험이 도움이 됩니다. 연습 세션 중에 3μL의 인도 잉크를 주입하면 주입 배치의 시각적 평가가 더 쉬워집니다. 올바르게 주사를 놓으면 동측 외측 심실과 종종 제 3 심실 및 반대측 심실에 검은 얼룩이 생깁니다. 잉크 주입은 말기 ...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
대표 결과에 나타난 데이터 수집에 기여해 주신 Kellie Breen Church 박사님, Michael Kreisman 씨, Jessica Jang 씨께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH) R00 HD104994(R.B.M.)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 18게이지 무딘 바늘 | SAI 주입 | B18-150 | |
| 18게이지 바늘 | BD 의료 | 305195 | |
| 알코올 패드 | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| 벤치 패드 | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| 베타딘 용액 | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| 부프레노르핀 | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | 규제 물질 |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| 유리 주사기 | Hamilton | 7634-01 | |
| 주사 바늘 | Hamilton | 7803-01 | 27 게이지, 스몰 허브 RN 바늘, 포인트 스타일: 4, 바늘 길이: 10cm, 각도: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane 기화기 | Vet 장비 | V-10 | |
| 실험실 테이프 | VWR | 89098-128 | |
| 의료용 산소 | Airgas | OX USPEA | |
| 파라포름알데히드 | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| 인산염 완충 식염수 | Fisher Scientific | J67802. K2 | |
| PulsaR 소프트웨어 | 오픈 소스, University of Otago | 참조 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| 실라스틱 튜빙(0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| 실라스틱 튜빙 (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| 멸균 식염수 | VWR | 101320-574 | |
| 설탕 | 피셔 사이언티픽 | S5-500 |
참고문헌
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- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
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- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
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- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
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재인쇄 및 허가
