초기 혈관 발달 중 변경된 혈류역학적 하중에 대한 모델로서의 조류 배아의 좌심방 결찰

요약

여기에서는 조류 배아에서 좌심방 결찰(LAL) 모델을 실행하기 위한 자세한 시각적 프로토콜을 제시합니다. LAL 모델은 벽 전단 응력 하중을 변화시키는 심장 내 흐름을 변경하여 저형성 좌심 증후군을 모방합니다. 이 어려운 미세 수술 모델의 문제를 극복하기 위한 접근 방식이 제시됩니다.

초록

4개의 방이 있는 성숙한 심실 구성, 배양 용이성, 이미징 접근 및 효율성으로 인해 조류 배아는 심혈관 발달을 연구하는 데 선호되는 척추동물 모델입니다. 정상적인 발달과 선천성 심장 결함의 예후를 이해하기 위한 연구에서 이 모델을 널리 채택하고 있습니다. 현미경 수술 기법을 도입하여 특정 배아 시점에서 정상적인 기계적 부하 패턴을 변경하고 다운스트림 분자 및 유전 캐스케이드를 추적합니다. 가장 일반적인 기계적 중재는 좌측 vitelline 정맥 결찰, conotruncal banding 및 좌심방 결찰(LAL)로, 혈류로 인한 벽내 혈관 압력과 벽 전단 응력을 조절합니다. 특히 난소에서 수행되는 경우 LAL은 매우 미세한 순차 미세 수술 수술로 인해 샘플 수율이 매우 작기 때문에 가장 어려운 중재입니다. 높은 위험성에도 불구하고 난자에서 LAL은 저형성 좌심 증후군(HLHS) 발병 기전을 모방하기 때문에 과학적으로 매우 가치가 있습니다. HLHS는 인간 신생아에서 관찰되는 임상적으로 관련된 복잡한 선천성 심장 질환입니다. in ovo LAL에 대한 자세한 프로토콜은 이 문서에 설명되어 있습니다. 간략하게, 수정된 조류 배아는 햄버거-해밀턴(HH) 단계 20 내지 21단계에 도달할 때까지 전형적으로 37.5°C 및 60% 일정한 습도에서 배양하였다. 달걀 껍질을 깨뜨리고 외막과 내막을 제거했습니다. 배아를 부드럽게 회전시켜 총심방의 좌심구를 노출시켰다. 10-0 나일론 봉합사로 사전 조립된 마이크로 매듭을 부드럽게 배치하고 왼쪽 심방 새싹 주위에 묶었습니다. 마침내, 배아를 원래 위치로 되돌려 놓았고, LAL이 완성되었다. 정상 심실과 LAL 기구 심실은 조직 압축에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 효율적인 LAL 모델 생성 파이프라인은 심혈관 구성 요소의 배아 발달 중 동기화된 기계적 및 유전적 조작에 초점을 맞춘 연구에 기여할 것입니다. 마찬가지로, 이 모델은 조직 배양 연구 및 혈관 생물학을 위한 교란된 세포 소스를 제공할 것입니다.

서론

선천성 심장 결손(CHD)은 비정상적인 배아 발달로 인해 발생하는 구조적 장애입니다¹. 유전적 조건 외에도 발병 기전은 변경된 기계적 부하에 의해 영향을 받습니다 ^2,3. 선천성 심장 질환인 저형성 좌심 증후군(HLHS)^{은 출생 시} 심실/대동맥이 제대로 발달하지 않아 4 사망률이 높다 ^5,6. 최근 임상 관리의 발전에도 불구하고 HLHS의 혈관 성장 및 발달 역학은 여전히 불분명하다⁷. 정상적인 배아 발달에서 좌심실(LV) 심내막과 심근은 초기 배아 심관 형성이 진행됨에 따라 심장 전구 세포에서 비롯됩니다. 심근 섬유주, 두꺼워지는 층 및 심근 세포 증식의 점진적인 존재가 보고된다². HLHS의 경우, 섬유주 리모델링의 변화와 좌심실 평탄화가 관찰되며, 이는 비정상적인 심근세포 이동으로 인한 심근 형성 부전의 원인이 된다 2,8,9,10

프로토콜

유정 백색 레그혼 알은 신뢰할 수 있는 공급업체로부터 얻어 대학에서 승인한 지침에 따라 배양합니다. 병아리 배아, 18단계(3일차)에서 24단계(4일차)(이 논문에 제시된 단계)는 유럽 연합(EU) 지침 2010/63/EU 및 미국의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 살아있는 척추동물로 간주되지 않습니다. 병아리 배아는 미국 법률에 따라 부화 19일 이후 "살아있는 동물"로 간주되지만 EU에서는 그렇지 않습니다. 각 알에는 부화 시작 날짜가 표시되어 있으며 늦어도 부화 10^일 째 되는 날까지 부화할 예정입니다. 알이 부화한 후 병아리는 인큐베이터에서 꺼냅니다. 이 프로토콜은 두 개의 벤치탑 운영 스테이션(스테이션 1 및 스테이션 2)에서 수행되며 특수 모델 생성 단계에 중점을 둡니다.

1. 미세수술 전 준비

1. 특정 병원균 무함유(SPF) 등급의 백신 개발 센터 또는 건조 폴리스티렌 용기에 담긴 깨지기 쉬운 배송 택배를 통해 신뢰할 수 있는 상업 공급업체 농장을 통해 수정란을 구입하십시오. 배양하기 전에 오염을 제거하기 위해 70% 에탄올에 적신 보푸라기가 없는 물티슈로 달걀 껍질을 부드럽게 청소하십시오.

결과

LAL 중재로 인한 구조적 및 형태학적 변화를 관찰하기 위해 고급 시간 분해 이미징 기술을 사용할 수^{있다 10}. 또한, LAL 샘플은 분자 및 생물학적 방법(^19,28)에도 적용할 수 있습니다. 표 1에는 LAL 모델 결과를 사용한 샘플 연구가 제공되어 있습니다. 이러한 맥락에서 LAL 중재는 HH20-21에 도달한 병아리 배아에서 수행되었습니다. 대조군(건강한) 심장과 LAL 심장은 모두 HH25-26의 배아에서 제거되었습니다. 이어서, 샘플을 4°C에서⁴% 파라포름알데히드(PFA)에 고정시켰다^6,15. 제거된 심장 샘플은 농도가 증가한 에탄올 용액(70%, 96% 및 100%)에서 각각 1시간 동안 탈수되었습니다. 마지막으로, 샘플을 RT에서 0.......

토론

HLHS에서는 구조적 결함으로 인해 혈류가 변경되어 왼쪽의 비정상적인 형태가 발생합니다 ^4,6. 본 모델은 HLHS의 진행을 더 잘 이해할 수 있는 실용적인 실험 시스템을 제공하며, 심지어 발병기전을 모방할 수도 있다⁸. 그러나 임상적으로 완전히 동등한 HLHS 동물 모델을 확립하는 것은 어려운 작업입니다. 여기에 제시된 조류 LAL 모델 외에도 생쥐, 태아 양, 개구리를 대상으로 한 최근 연구에서는 HLHS 예후의 형태학적, 혈류역학적, 병태생리학적 특징을 재현하려고 시도했습니다. 마우스 배아에서, 기계적 부하는, 배아의 날 (ED) 14.5 (병아리 배아의 경우 대략 HH40-41)³⁴에 태아 개입을 통해 LA에 주입 된 색전술을 통해 변경됩니다. 양성 색전술을 받은 태아의 총 48%는 작은 LV와 역행성 대동맥 흐름으로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10-0 나일론 외과용 봉합사	Ethicon
Elastica van Gieson 염색 키트	Sigma-Aldrich	115974	조직학적 절편에서 결합 조직을 염색하기 위해
에탄올 절대	Interlab	64-17-5	살균 단계를 위해 절대 에탄올을 증류수로 희석하여 70% 에탄올을 얻었습니다.
인큐베이터	KUHL, Flemington, New Jersey-US	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	알 재부화를 위한 밀봉 단계
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	조직 임베딩 매체
스테레오 현미경	Zeiss Stemi 508	스테이션 1에서 사용되는 Stemi 508
스테레오 현미경	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	스테이션 2에서 사용
핀셋 (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, 스위스		배아
핀셋 (Super Fine Dumont #5SF)을 반환하는 데 사용됩니다	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	배아의 막을 제거하는 데 사용됩니다

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