방법 논문

물 샘플에서 Leptospira 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응 및 점-블롯 혼성화

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DOI:

10.3791/65435

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2024년 6월 14일

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1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

이 논문에서

요약

이 연구에서는 물 샘플의 세 가지 주요 clade에서 Leptospira 를 검출하도록 dot-blot 응용 프로그램을 설계했습니다. 이 방법을 사용하면 항-디곡시제닌 항체에 의해 쉽게 검출되는 디곡시제닌 표지 프로브에 의해 특이적으로 표적화된 최소 DNA 양을 식별할 수 있습니다. 이 접근 방식은 스크리닝 목적에 유용하고 만족스러운 도구입니다.

초록

도트 블롯은 운반체 DNA가 있는 상태에서 프로브 교잡에 의해 특이적으로 표적이 되는 최소한의 DNA를 식별할 수 있는 간단하고 빠르며 민감하고 다재다능한 기술입니다. 이는 알려진 양의 DNA를 나일론 멤브레인과 같은 불활성 고체 지지체에 전달하여 도트 블롯 장치를 사용하고 전기 영동 분리 없이 수행하는 것을 기반으로 합니다. 나일론 멤브레인은 높은 핵산 결합력(400 μg/cm2), 고강도의 장점이 있으며 양전하 또는 중성으로 대전됩니다. 사용된 프로브는 디곡시게닌(digoxigenin, DIG)으로 길게 표지된 18-20개의 염기로 구성된 매우 특이적인 ssDNA 단편입니다. 프로브는 렙토스피라 DNA와 결합합니다. 프로브가 표적 DNA와 하이브리드화되면 항-디고시제닌 항체에 의해 검출되어 X선 필름에 드러난 방출을 통해 쉽게 검출할 수 있습니다. 방출이 있는 점은 관심 DNA 조각에 해당합니다. 이 방법은 프로브의 비동위원소 라벨링을 사용하며, 이는 매우 긴 반감기를 가질 수 있습니다. 이 표준 면역 표지의 단점은 동위원소 프로브보다 민감도가 낮다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 도트 블롯 분석을 결합하여 완화됩니다. 이 접근 방식을 통해 표적 염기서열과 검출을 강화할 수 있습니다. 또한, 잘 알려진 표준물질의 연속 희석과 비교할 때 정량적 응용 분야로 사용될 수 있습니다. 물 샘플의 세 가지 주요 clades에서 Leptospira 를 검출하기 위한 dot-blot 응용 프로그램이 여기에 제시되어 있습니다. 이 방법론은 렙토스피나선형 DNA의 존재에 대한 증거를 제공하기 위해 원심분리에 의해 농축된 많은 양의 물에 적용할 수 있습니다. 이것은 일반적인 스크리닝 목적을 위한 가치 있고 만족스러운 도구이며, 물에 존재할 수 있는 다른 배양 불가능한 박테리아에 사용할 수 있어 생태계에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

서론

인간의 렙토스피라증은 주로 환경적 요인에 의해 발생한다 1,2. 호수, 강 및 하천에 렙토스피라가 존재한다는 것은 야생 동물과 결국 이러한 수역과 접촉할 수 있는 가축 및 생산 동물 사이에서 렙토스피라증이 전염된다는 지표입니다 1,3,4. 또한, 렙토스피라(Leptospira)는 하수, 정체 및 수돗물을 포함한 비자연적 자원에서 확인되었습니다 5,6.

렙토스피라는 전 세계에 분포하는 박테리아 7,8이며, 보존 및 전파에 있어 환경의 역할은 잘 알려져 있습니다. 렙토스피라(Leptospira)는 pH와미네랄이 다양한 음용수9와자연 수역1에서 생존할 수 있다. 또한 증류수(10)에서 장기간 생존할 수 있으며, 일정한 pH(7.8)에서는 최대 152일까지 생존할 수 있다11. 더욱이, 렙토스피라(Leptospira)는 가혹한 조건에서도 생존하기 위해 박테리아 컨소시엄(bacterial consortium)에서 상호작용할 수 있다12,13. 그것은 Azospirillum 및 Sphingomonas와 함께 담수에서 생물막의 일부일 수 있으며 49 °C14,15를 초과하는 온도를 성장시키고 견딜 수도 있습니다. 또한 물에 잠긴 토양에서 증식할 수 있으며 최대 379일(16) 동안 생존할 수 있으며, 1년 동안 질병을 유발할 수 있는 능력을 보존할 수 있습니다17,18. 그러나 수역 내의 생태와 수역 내에 어떻게 분포되어 있는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

발견 이후 Leptospira 속에 대한 연구는 혈청 학적 검사를 기반으로했습니다. 현재 세기가 되어서야 분자 기술이이 spirochaete의 연구에서 더 널리 퍼졌습니다. 점-블롯은 (1) 16S rRNA 및 ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)19,20을 기반으로 하는 동위원소 프로브를 사용하거나, (2) 소변21에 적용되는 인간 렙토스피라증에 대한 나노골드 기반 면역분석법으로, 또는 (3) 소 소변 샘플22에 대한 항체 기반 분석법으로 사용하는 식별에 거의 사용되지 않았습니다. 이 기술은 원래 동위원소 프로브를 기반으로 했기 때문에 사용되지 않았습니다. 그러나 PCR과 결합하여 향상된 결과를 얻을 수 있는 잘 알려진 기술이며 비동위원소 프로브를 사용하기 때문에 안전한 것으로 간주됩니다. PCR은 샘플의 미량에서 발견될 수 있는 특정 DNA 단편을 증폭하여 Leptospira DNA의 농축에 중요한 역할을 합니다. 각 PCR 주기 동안 표적 DNA 단편의 양은 반응에서 두 배가 됩니다. 반응이 끝날 때, 앰플리콘은 100만23 이상의 계수로 곱해졌다. PCR에 의해 증폭된 생성물은 아가로스 전기영동에서 종종 보이지 않지만, 도트 블롯24,25,26에서 DIG 표지 프로브와의 특정 혼성화를 통해 보이게 됩니다.

도트 블롯 기법은 간단하고 견고하며 수많은 샘플에 적합하므로 자원이 제한된 실험실에서 사용할 수 있습니다. 이는 (1) 구강 세균27, (2) 식품 및 배설물과 같은 다른 샘플 유형(28), (3) 배양 불가능한 세균29의 식별을 포함한 다양한 박테리아 연구에 사용되어 왔으며, 종종 다른 분자 기술과 일치합니다. 도트 블롯 기법이 제공하는 장점은 다음과 같습니다 : (1) 멤브레인은 200 μg / cm2 이상의 핵산 및 최대 400 μg / cm2 와 결합 할 수있는 높은 결합 능력을 가지고 있습니다. (2) 도트 블롯 결과는 특별한 장비 없이 시각적으로 해석할 수 있으며 (3) 실온(RT)에서 수년 동안 편리하게 보관할 수 있습니다.

렙토스피라(Leptospira) 속은 병원성, 중간성, 부생식물군(saprophytic clades)30,31로 분류되었다. 이러한 clade 간의 구별은 lipL41, lipL32 및 16S rRNA와 같은 특정 유전자를 기반으로 달성할 수 있습니다. LipL32는 병원성 clades에 존재하며 다양한 혈청학적 및 분자 도구에서 높은 민감도를 나타내는 반면, 부생식물 종21에는 없습니다. 하우스키핑 유전자 lipL41은 안정적인 발현으로 알려져 있으며 분자 기술(32)에 사용되는 반면, 16S rRNA 유전자는 분류에 활용됩니다.

이 방법론은 원심분리에 의해 농축된 많은 양의 물에 적용할 수 있습니다. 이를 통해 수역 내의 다양한 지점과 깊이를 평가하여 렙토스피럴 DNA의 존재와 그것이 속한 클래드를 감지할 수 있습니다. 이 도구는 생태학적 및 일반 스크리닝 목적 모두에 유용하며 물에 존재할 수 있는 다른 배양 불가능한 박테리아를 감지하는 데에도 사용할 수 있습니다.

또한 PCR 및 도트 블롯 분석은 정교하거나 고가의 장비가 없는 실험실을 포함하여 다양한 실험실에서 기술적으로나 경제적으로 저렴합니다. 이 연구는 자연 수역에서 수집된 물 샘플에서 3개의 렙토스피라 군을 식별하기 위해 디곡시게닌 기반 점-블롯을 적용하는 것을 목표로 합니다.

박테리아 균주
이 연구에는 12종의 렙토스피라 혈청형(Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, Wolffi)이 포함되었습니다. 이 혈청형은 멕시코 국립 자치 대학교 수의학 및 동물원 학부의 미생물학 및 면역학과 컬렉션의 일부이며 현재 미세 응집 검사(MAT)에 사용되고 있습니다.

모든 렙토스피라 혈청형을 EMJH에서 배양하고, 이들의 DNA를 상업용 DNA 추출 키트를 사용하여 추출하였다( 재료 표 참조). 12개의 혈청형의 게놈 DNA 혼합물을 렙토스피라 병원성 군집에 대한 양성 대조군으로 사용했습니다. 렙토스피라 중간 군집의 양성 대조군으로, 렙토스피라 페이네이 혈청형 허스트브리지 균주 BUT6로부터의 게놈 DNA를 포함하였고, 렙토스피라 부생식물 군집에 대한 양성 대조군으로서, 렙토스피라 biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I의 게놈 DNA도 포함하였다.

음성 대조군은 빈 플라스미드, 관련 없는 박테리아(Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli)의 DNA, 그리고 비템플릿 대조군으로 작용한 PCR 등급의 물로 구성되었습니다.

물 샘플
Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W)에서 층화 우연 샘플링 방법을 사용하여 12개의 시험 채취 샘플을 수집했습니다. 이 샘플은 표층, 10cm 및 30cm의 세 가지 깊이에서 획득되었습니다(그림 1A, B). 물 수집 절차는 멸종 위기에 처한 종이나 보호 종에 영향을 미치지 않았습니다. 각 샘플은 멸균된 15mL 미세 원심분리기 튜브에서 수집되었습니다. 샘플을 수집하기 위해 각 튜브를 물에 부드럽게 담그고 선택한 깊이로 채운 다음 밀봉했습니다. 샘플은 22°C에서 유지되었으며 처리를 위해 즉시 실험실로 운반되었습니다.

각 샘플은 실온에서 20분 동안 8000 x g 의 멸균 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 원심분리하여 농축했습니다. 이 단계를 반복하여 모든 샘플이 하나의 튜브에 농축될 때까지 이 튜브를 DNA 추출에 사용했습니다(그림 1C).

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그림 1: 원심분리에 의한 물 샘플의 농도. (A) 물 샘플링 연못, (B) 자연 하천. (C) 원심분리 기반 물 샘플 처리는 필요한 만큼 반복적인 단계로 (n). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

DNA 추출
총 DNA는 제조업체의 지침에 따라 상용 Genomic DNA 키트를 사용하여 분리하였다( 재료 표 참조). DNA 추출은 20 μL의 용출 완충액에서 용출되고, DNA 농도는 260-280 nm에서 UV 분광 광도계로 측정하고, 사용할 때까지 4 °C에서 보관하였다.

PCR 증폭
PCR 표적은 16개의S rRNA, lipL41 및 lipL32 유전자로, Leptospira 속의 DNA를 식별하고 병원성, 부생성 및 중간성의 세 가지 분류를 구별할 수 있습니다. 프라이머와 프로브 설계는 모두 Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. 및 Branger et al.33,34,35,36,37의 이전 작업을 기반으로 했습니다. 각 프로브, 프라이머 및 증폭된 단편의 서열은 표 1에 기재되어 있으며, 참조 서열과의 정렬은 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5에 제공되어 있습니다. PCR 시약 및 열순환 조건은 프로토콜 섹션에 설명되어 있습니다.

증폭 산물은 보충 그림 1에 표시된 바와 같이 에티듐-브로마이드 검출과 함께 60V에서 45분 동안 TAE(40mM Tris 염기, 20mM 아세트산 및 1mM EDTA, pH 8.3)의 1% 아가로스 겔에서 전기영동 분리를 통해 시각화했습니다. 각 혈청형에서 수득한 게놈 DNA는 병원성 렙토스피라의 경우 L. interrogans (4, 691, 184 bp)38의 게놈 크기, 부생식물성 렙토스피라의 경우 L. biflexa(3, 956, 088 bp)39의 게놈 크기를 기준으로 각 PCR 반응에서 6 x 106 내지 1 x 104 게놈 등가 사본(GEq) 범위의 농도로 사용되었으며, 및 등록 번호 AKWZ00000000.2를 가진 L. fainei serovar Hurstbridge 균주 BUT6 (4, 267, 324 bp)의 게놈 크기.

프로브의 민감도는 각 실험에서 각 병원성 혈청형, L. biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I 및 L. fainei 혈청형 Hurstbridge 균주 BUT6의 DNA로 평가했습니다. PCR 및 점-블롯 혼성화 분석의 특이성을 평가하기 위해 비관련 박테리아의 DNA를 포함했습니다.

표 1: Leptospira의 병원성, 부생식물 및 중간 clades를 식별하기 위한 제품을 증폭하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Dot-blot hybridization 어세이
이 기술은 DNA 샘플이 놓인 구멍이 점 모양을 가지고 있기 때문에 도트 블롯이라고 불리며, 진공 흡입에 의해 제자리에 고정되도록 흡입되면 이러한 모양을 얻습니다. 이 기술은 Kafatos et al.40에 의해 개발되었습니다. 이 기술을 사용하면 각 PCR 양성 샘플에서 Leptospira의 반 정량화가 가능합니다. 이 프로토콜은 실온에서 NaOH 0.4M를 사용한 변성으로 구성되며, 6 x 106 to 1 x 104 leptospires에 해당하는 30ng - 0.05ng의 Leptospira DNA가 있는 샘플은 96웰 도트 블롯 장치를 사용하여 나일론 멤브레인에 블롯됩니다. 고정화 후 DNA는 120mJ 자외선에 노출되어 멤브레인에 결합됩니다. 각 DNA 프로브는 3' 말단에서 말단 전이효소 촉매 단계에 의해 digoxigenin-11 dUTP와 접합됩니다(Digoxigenin은 리포터41로 사용되는 Digitalis purpurea에서 얻은 식물 스테로이드입니다). 특정 온도에서 라벨링된 DNA 프로브(50 pmol)를 타겟 DNA에 엄격하게 혼성화한 후, DNA 하이브리드는 기질 CSPD와 공유 결합된 항-디고시게닌 알칼리 인산가수분해효소 항체와의 화학발광 반응에 의해 시각화됩니다. 발광은 X선 필름에 노출되어 캡처됩니다(그림 2).

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그림 2: PCR-dot-blot assay를 위한 절차 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

1. 시료 전처리

  1. 4°C에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리하여 각 물 샘플을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 농축합니다. 이 단계를 필요한 만큼 반복하여 샘플을 250μL의 부피로 농축합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용하십시오( 재료 표 참조).
  3. 사용할 dot-blot 프로브에 따라 특정 PCR을 수행합니다(표 1).
    1. 각 물 샘플 또는 참조 게놈-DNA에서 1 X 완충액, 2.5 단위의 Taq 중합효소, 1 μM의 각 프라이머, 0.2 mM의 각 dNTP, 1.5 mM MgCl2 및 100 ng의 표적 DNA를 포함하는 25 μL의 최종 부피로 PCR 튜브에서 증폭을 수행합니다.
    2. 열순환 조건에 따라 열순환기에서 PCR 반응을 프로그래밍합니다(표 2).
    3. 사용할 때까지 4 °C에서 반응을 보관하십시오.
  4. 블롯팅할 각 PCR 산물의 10μL를 96웰 플레이트의 별도 웰에 넣습니다.
  5. 각 웰에 40μL의 TE를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
    알림: 96웰 플레이트는 밀봉하여 4°C에서 밤새 보관할 수 있습니다. 보충 파일 6 에 제공된 지침에 따라 프로토콜에 대한 버퍼 및 솔루션을 준비합니다. 그림 3 은 시료 전처리 단계를 보여줍니다.

표 2: 16S, lipL41 및 lipL32 유전자에 대한 PCR 열순환 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: PCR 및 시료 전처리. 특정 PCR 프로토콜을 적용하여 PCR 산물을 마이크로타이터 플레이트로 옮기고 40μL의 TE를 각 웰에 첨가했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 도트 블롯 장치 조립

알림: 도트 블롯 장치의 조립은 그림 4에 나와 있습니다. 절차 중에는 장갑을 착용하여 알칼리 용액을 다루고 나일론 멤브레인을 오염으로부터 보호하십시오.

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그림 4: 도트 블롯 장치 조립. 여과지와 나일론 멤브레인(이전에 10 X SSPE에 적셔짐)은 올바른 순서로 배열해야 합니다. 진공 청소기를 적용하기 전에 어셈블리를 나사로 단단히 고정해야 합니다. 각 웰은 TE로 세척해야 하며 PCR 산물은 해당 웰에 로드됩니다. 멤브레인을 통해 PCR 산물을 이송한 후, 각 웰을 TE로 다시 세척하고 건조시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 나일론 멤브레인( 재료 표 참조)과 여과지를 12 x 8.5cm 크기의 시트로 자릅니다.
  2. 멤브레인에 영구 마커를 표시하십시오.
  3. 올바른 방향을 나타내기 위해 한쪽 가장자리에 가위로 노치를 만드십시오. 마크를 사용하여 샘플 주문을 기억하십시오.
  4. 멤브레인과 여과지를 10 X 식염수-인산나트륨-EDTA 완충액(SSPE; 3M NaCl, 0.2MNaH2PO4및 0.02M EDTA, pH 7.4)으로 적십니다(보충 파일 6). 깨끗하고 뭉툭한 핀셋으로 멤브레인을 처리하십시오.
  5. 도트 블롯 챔버를 조립합니다. 먼저 여과지, 플라스틱 씰 위의 멤브레인. 나사로 덮개를 십자형으로 고정합니다.
  6. 챔버를 진공에 연결하고 각 웰에 100μL의 TE를 배치하고 진공을 1분 동안 유지한 다음 중지합니다.
  7. 저속으로 진공을 켜고 각 샘플의 50μL를 도트 블롯 장치의 멤브레인에 있는 해당 웰에 로드합니다(미리 결정된 멤브레인 분포에 따름).
    참고: 각 샘플을 dot-blot 챔버에 넣기 전에 hemagglutination 96 well plate에서 균질화합니다.
  8. 진공 청소기가 멤브레인을 건조시키도록 합니다. 필요한 경우 챔버를 부드럽게 두드려 샘플의 기포를 해제합니다.
  9. 연속 진공으로 100μL의 TE를 넣고 건조시켜 각각을 잘 세척합니다.
    알림: 전송을 완료한 후에는 먼저 펌프의 전원을 끄고 분리하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 역류가 장치에 들어갈 수 있습니다. 양전하를 띤 나일론 멤브레인을 사용하는 경우 DNA는 변성 단계가 필요하지 않지만, 다른 불활성 지지체를 사용하는 경우 사전 변성 단계 및 알칼리 기반 변성이 필요할 수 있습니다41.

3. DNA 변성 및 고정

참고: 그림 5 는 DNA 멤브레인 고정 절차를 보여줍니다.

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그림 5: DNA-membrane 고정 절차. DNA는 알칼리성 용액에서 변성됩니다. 다음으로, 10 X SSPE로 중화하고 멤브레인을 건조시킨다. 다음으로, 멤브레인을 투과 조명합니다. 멤브레인은 2 X SSPE로 재수화되고 하룻밤 동안 사전 혼성화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 실온에서 10분 동안 0.4M NaOH로 멤브레인을 배양합니다.
  2. 실온에서 10분 동안 10 X SSPE로 멤브레인을 평형화합니다.
  3. 멤브레인을 80°C에서 2시간 동안 건조시킵니다.
  4. 120mJ UV 광선으로 3분 동안 투과합니다. 샘플이 UV 광원을 향하도록 뒤집어 놓으십시오. UV 가교제를 사용하는 경우 샘플이 위쪽을 향하고 있는지 확인하고 이 단계를 두 번 반복합니다.
    알림: 멤브레인은 UV 가교 전에 완전히 건조되어야 합니다. DNA는 나일론 멤브레인에 대한 공유 결합에 의해 고정됩니다. 각 가교는 약 0.6-0.8 kJ / m2 의 대부분의 혼성화 실험에서 최적의 UV 조사 선량으로 약 18 ''에서 1'를 소요합니다.
    자외선에 노출되면 눈과 피부에 해롭습니다. 적절한 보호 장비를 착용하고 맨살에 노출되지 않도록 하십시오.
  5. 멤브레인을 2 X SSPE로 10분 동안 세척합니다.
  6. 멤브레인을 조심스럽게 접어 교잡 튜브에 삽입합니다(15mL 미세 원심분리기 튜브 사용).
  7. 10mL의 사전 혼성화 용액(보충 파일 6)을 튜브에 추가하고 42°C에서 밤새 배양합니다. 누출을 방지하기 위해 튜브가 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오.

4. 하이브리드화

  1. 혼성화 튜브에서 사전 혼성화 용액 5mL를 제거합니다. 5mL를 두 번째로 사용하려면 다른 튜브에 보관하고 -4 °C에서 보관하십시오.
  2. 라벨링된 프로브(표 1) 15μL를 혼성화 튜브에 추가합니다. 팁을 용액에 헹구어 라벨이 부착된 프로브가 희석액에 완전히 주입되었는지 확인합니다.
    참고: DNA 프로브의 결합은 항원-항체 결합만큼 강하지 않습니다. 따라서 샘플에서 프로브 또는 DNA 농도의 변화는 방출되는 형광의 강도에 영향을 미칠 수 있습니다. DNA 프로브는 화학량론(화학량론)으로, DNA에 결합된 프로브 분자의 수가 용액에 존재하는 DNA 분자의 수와 동일하다는 것을 의미합니다. 그림 6 은 프로브 혼성화를 보여줍니다.
  3. 42 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  4. DNA 프로브 DIG 라벨링을 수행합니다. 표 3 에 지정된 지침에 따라 시약을 혼합한 다음 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 증류수 80μL를 추가하고 테일 프로브를 4°C에서 보관합니다.

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그림 6: 프로브 혼성화. 혼성화 완충액의 부피가 조정되고, 디곡시게닌 표지된 프로브가 통합되어 하룻밤 동안 프로브의 혼성화를 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 디곡시게닌(digoxigenin, DIG)으로 라벨링하는 프로브용 시약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

5. Chemiluminescence (anti-DIG 태깅)

  1. 실온에서 2 X SSPE/0.1% SDS로 10분 동안 멤브레인을 두 번 세척합니다.
  2. 프로브의 어닐링 온도에서 15분 동안 5 X SSPE/0.1% SDS로 멤브레인을 배양합니다.
    알림: 이 단계에서는 뚜껑이 있는 용기를 사용하여 가능한 한 오랫동안 온도를 유지하십시오. 멤브레인 전체에서 균일하고 일정한 온도를 보장합니다. 각 세척의 대략적인 부피는 표시된 용액의 100mL입니다.
  3. 멤브레인을 Buffer 1(Supplementary File 6)로 실온에서 5분 동안 한 번 세척합니다.
  4. 멤브레인을 Buffer 2(Supplementary File 6)로 실온에서 30분 동안 한 번 세척합니다.
  5. 버퍼 2로 멤브레인을 세척하고 항-디곡시제닌 항체(15μL)( 재료 표 참조)를 추가한 다음 45분 동안 배양합니다(배양 시간은 30-60분으로 다를 수 있음). 이 2차 항체는 검출을 위해 프로브에 태그를 지정합니다.
    참고: 멤브레인은 4-8°C에서 하룻밤 동안 항-디고시제닌 항체와 함께 버퍼 2에 보관할 수 있습니다. 화학발광 공정의 Anti-DIG 태깅은 그림 7에 나와 있습니다.

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그림 7: 화학발광 공정의 Anti-DIG 태깅. 결합되지 않은 핵산은 완충 용액으로 제거됩니다. 프로브가 표적 DNA와 정렬되고 초과분이 제거됩니다. 멤브레인을 차단 1 X 완충액으로 차단하고 anti-DIG 항체를 첨가합니다(1:10000). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 화학발광(기판 적용)

  1. 멤브레인을 버퍼 1에서 실온에서 15분 동안 두 번 세척합니다.
  2. 실온에서 버퍼 3( 보충 파일 6 참조)에 5분 동안 한 번 세척하여 멤브레인이 대부분의 버퍼를 배출하도록 하여 거의 건조 상태로 둡니다.
  3. 바로 사용할 수 있는 CSPD(디소듐 3-(4-메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2′-(5′-클로로) 트리시클로[3.3.1.13,7] 데칸}-4-일) 페닐 포스페이트, 재료 표 참조)를 추가하고 5분 동안 그대로 두십시오(댐핑 손가락으로 CSPD를 한쪽에서 다른 쪽으로 균질화).
  4. 멤브레인 치수에 맞는 투명 비닐 봉지(12.5 x 9cm)에 멤브레인을 넣습니다. 기포를 조심스럽게 제거하고 CSPD를 고르게 분포시킨 다음 백을 열 밀봉합니다.
  5. 멤브레인을 37°C의 수조에서 15분(최대 30분까지 가능) 동안 배양하고 샘플이 있는 멤브레인이 잘 잠길 수 있도록 아래쪽으로 배치해야 합니다. 온도가 일정하게 유지되고 멤브레인 전체에 잘 분포되어 있는지 확인하십시오.
  6. 비닐 봉지를 말리고 이미 사용한 방사선 촬영 필름에 스카치 테이프로 고정합니다. 이렇게 하면 노출 절차 중에 쉽게 다룰 수 있습니다.
    참고: 그림 8 은 화학발광 공정의 기판 적용을 보여줍니다.

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그림 8: 화학발광 공정의 기판 적용. 유리 항체가 제거되고 기판 CSPD(1:250)가 멤브레인에 추가됩니다. 반응은 37°C에서 배양에 의해 활성화되고 멤브레인은 X선 필름에 화학발광을 기록하도록 배열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 화학발광(검출)

  1. 노출 절차를 수행합니다. 암실에서 현상액과 정착액 용액( 재료 표 참조)을 각 트레이에 준비합니다.
  2. 어두운 곳에서는 고정 멤브레인을 새 방사선 필름을 향하게 조심스럽게 놓고 방사선 촬영 카세트에 삽입합니다( 재료 표 참조).
  3. 노출 시간을 등록합니다. 노출 시간은 1분에서 30분 이상으로 다양할 수 있습니다. 5분으로 시작하여 그에 따라 시간을 조정하십시오.
  4. 현상액에 X선 필름을 적시고 수돗물(15-45초)로 부드럽게 헹굽니다.
  5. X선 필름을 정착액에 1-3분 동안 적시고 수돗물(45초)로 부드럽게 헹굽니다.
  6. X선 필름을 공기 중에서 건조시키고 눈에 보이는 흰색 라이트박스에 분석을 문서화합니다.
    알림: X선 노출 시간 동안 멤브레인을 흔들지 마십시오. 감지 프로세스는 그림 9에 나와 있습니다.
  7. 결과 해석을 진행합니다. 노출된 X선 필름에서 방출되는 점은 시각적으로 위치를 찾을 수 있으며 프로브의 혼성화로 DNA 조각에 해당합니다. 방출되는 신호의 강도는 발광과 노출 시간에 따라 다릅니다.
    알림: 멤브레인은 실온에서 몇 달 동안 여과지 사이에서 건조되어 보관할 수 있습니다.

figure-protocol-7
그림 9: 화학발광 공정 검출. 어두운 조건에서 멤브레인은 X선 카세트 내부의 X선 필름에 노출됩니다. 다음으로, 박람회 기간 동안 방치한 후 X-ray 필름을 현상하여 고정했습니다. 마지막으로 공기 건조하여 해석했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 멤브레인 탈혼성화(de-hybridization) 절차

  1. 멤브레인을 증류수로 10분 동안 두 번 세척합니다.
  2. 53°C에서 0.4M NaOH로 20분 동안 멤브레인을 세척합니다(2회).
  3. 2 X SSPE로 10분 동안 멤브레인을 두 번 세척합니다.
  4. 멤브레인을 실온에서 건조시키십시오.
  5. 멤브레인을 유지하고 프로토콜의 3.5단계로 돌아갑니다.
    참고: 멤브레인은 4-8°C에서 하룻밤 동안 사전 혼성화 버퍼에 보관할 수 있습니다. 다음 날, 42°C에서 1시간 동안 배양하여 재시작하여 사전 혼성화 완충액이 온도에 도달할 수 있도록 합니다. 그런 다음 프로토콜의 3.5단계로 진행합니다.

결과

이 기술의 효과를 평가하기 위해 각 Leptospira 혈청형의 순수 배양에서 얻은 게놈 DNA와 clade 특이적 프로브를 함께 사용했습니다. 멤브레인은 각 혈청형에 대해 PCR 반응당 100ng의 게놈 DNA로 제조한 후, 비관련 박테리아의 8개 게놈 DNA와 임시 렙토스피라 혈청형의 다양한 농도의 게놈 DNA로 제조했습니다. 각 분석에는 양성, 음성 및 비템플릿 대조군이 포함되었습니다. 이러한 비관련 게놈 DNA는 점-블롯 프로브에 대한 친화성을 나타내지 않았습니다. 멤브레인 분포 및 도트 블롯 멤브레인은 보충 그림 2, 보충 그림 3, 보충 그림 4, 보충 그림 5, 보충 그림 6, 보충 그림 7에 나와 있습니다. 부생식물 군에 관해서는, 프라이머 DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD로 증폭된 1059 bp의 PCR 산물과 함께 DB_Saproprobe을 사용하고, 프라이머 DB_16SSapREV 및 DB_16SSapFWD로 증폭된 517 bp의 PCR 산물을 Leptospira biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I의 게놈 DNA와 함께 사용하고, 0.05-0.1 ng의 부생식물 DNA를 검출할 수 있었습니다(보충 그림 2 및 보충 그림 3). 마찬가지로, 중간 clade의 검출을 위해, DB_Interprobe DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD로 증폭 된 1059 bp의 PCR 산물과 Leptospira fainei serovar Hurstbridge 균주 BUT6의 게놈 DNA와 DB_16SInterREV 및 DB_16SInterFWD로 증폭 된 PCR 산물을 사용한다 (보충 도 4 및 보충 도 5)를 통해 중간 DNA의 약 0.1ng을 검출할 수 있었다. 유사하게, 프라이머 DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD에 의해 증폭된 1059 bp의 PCR 산물과 함께 DB_16SPathoprobe를 사용하는 병원성 클레이드 또는 병원성 Leptospira 혈청형으로부터 게놈 DNA 믹스와 DB_lipL41FWD 프라이머 DB_lipL41REV에 의해 증폭된 479 bp의 PCR 산물을 가진 DBlipL41 프로브의 경우, 병원성 DNA의 0.3-0.6ng 범위의 DNA 농도를 검출할 수 있었습니다(보충 그림 6 및 추가 그림 7).

3개의 clade를 식별하도록 설계된 분석은 각 clade에 대해 개별적으로 사용할 수 있습니다. 그러나 귀중하고 희소한 샘플의 경우 1058-1069 bp 제품을 증폭하는DB_16 SPathoREV 및 DB_16S PathoFWD와 같은 프라이머로 단일 멤브레인을 준비할 수 있습니다. 그런 다음 이 제품은 DB_Interprobe, DB_Saproprobe 및 DB_16SPathoprobe와 개별적으로 혼성화할 수 있으며, 각각에 앞서 탈혼성화 단계(8단계)를 수행할 수 있습니다. 이 접근 방식을 사용하면 동일한 멤브레인에 있는 모든 클래드를 식별할 수 있습니다.

현장 물 샘플에는 lipL32 프로브 프로토콜이 적용되었습니다. 각 물 샘플의 DNA는 PCR 반응당 100ng의 농도로 사용되었습니다. 또한 100ng의 Leptospira 게놈 DNA를 15mL 증류수 샘플에 스파이크하는 것으로 구성된 DNA 추출 프로토콜 제어가 포함되었습니다. 음성 및 양성 대조군도 포함되었습니다(그림 10).

표 4: 물 샘플 설명 및 깊이. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 10: 각 물 샘플의 도트 블롯 분석. (A) 멤브레인 분포 및 (B) DB_lipL32probe의 도트 블롯 및 DB_lipL32REV 프라이머 생성물(262 bp) 및 현장 물 샘플의 DB_lipL32FWD. Pond 3의 표면은 긍정적인 결과를 보여주며 추출 프로토콜 제어와 포지티브 제어 모두 강한 신호를 갖습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

물 샘플 설명은 표 4에 나와 있으며 점-블롯 멤브레인 분포 및 이미지는 그림 9에 나와 있습니다. 점 A7은 렙토스피럴 DNA가 3번 연못의 표면에 존재했음을 보여준다. 연못 3에 존재하는 DNA 농도를 결정하기 위해 렙토스피라 혈청형과 lipL32 프로브의 혼합물에 대한 알려진 DNA 농도를 가진 점-블롯 분석을 수행했습니다(그림 11). 멤브레인은 각 점에서 100ng에서 1 x 10-13ng 까지 분포된 게놈 DNA로 제조되었습니다. 의심할 여지 없이 검출할 수 있는 최소 농도는 약 0.3ng였으며, 이는 물 샘플에서 6 x 105GEq 에 해당합니다.

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그림 11: Leptospira serovars와 lipL32 probe의 혼합물에 대해 알려진 DNA 농도를 사용한 도트 블롯 분석. (A) 병원성 Leptospira 혈청형의 게놈 DNA 혼합물의 희석액(1:2)과 DB_lipL32FWD 프라이머 DB_lipL32REV 및 프라이머의 생성물(262 bp)과 DB_lipL32probe의 막 분포 및 (B) 점-블롯. 프로브의 신호는 3.91 x 10-1 ng의 Leptospira DNA 혼합물까지 쉽게 감지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 전기영동 분리로 시각화된 PCR 증폭 산물. 레인 1. 분자량 마커 100 bp DNA Ladder. 레인 2. 병원성 렙토스피라 DNA 혼합물을 주형으로 하는 lipL32 유전자를 기반으로 한 PCR; 레인 3. 병원성 렙토스피라 DNA 혼합물을 주형으로 하는 lipL41 유전자를 기반으로 한 PCR; 레인 4. 병원성 렙토스피라 DNA 혼합물을 주형으로 하는 16S rRNA 유전자를 기반으로 하는 PCR; 레인 5. 프라이머 DB_16SSapREV 및 DB_16SSapFWD 및 Leptospira biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I DNA를 주형으로 하는 16S rRNA 유전자를 기반으로 하는 PCR; 레인 6. 프라이머 DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD를 가진 16S rRNA 유전자 기반 PCR, 및 Leptospira biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I DNA를 주형으로 하는 PCR; 레인 7. 프라이머 DB_16SInterREV 및 DB_16SInterFWD 및 Leptospira fainei, 혈청형 Hurstbridge 균주 BUT6 DNA를 주형으로 사용하는 16S rRNA 유전자를 기반으로 하는 PCR; 8차선. 프라이머 DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD 및 Leptospira fainei, 혈청형 Hurstbridge 균주 BUT6 DNA를 주형으로 사용하는 16S rRNA 유전자를 기반으로 한 PCR. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: (A) DB_Saproprobe의 막 분포 및 (B) 및 생성물(1059 bp)의 도트 블롯 DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I의 게놈 DNA의 도트 블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3 : (A) 멤브레인 분포 및 (B) Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I의 게놈 DNA의 DB_16SSapREV 및 DB_16SSapFWD의 프라이머 생성물(517 bp)을 사용한 DB_Saproprobe의 도트 블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: (A)SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD의 프라이DB_16머 생성물(1059 bp)과 Leptospira fainei serovar Hurstbridge 균주 BUT6의 게놈 DNA를 사용한 DB_Interprobe의 점 블롯 분포 (A) 막 분포 및 (B) 점-블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 5 : (A) 멤브레인 분포 및 B) DB_Interprobe 및 생성물 (299-301 bp)의 DB_16SInterREV 및 DB_16SInterFWD와 Leptospira fainei serovar Hurstbridge 균주 BUT6의 게놈 DNA. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: (A) 병원성 Leptospira 혈청형의 게놈 DNA 혼합물을 사용한 DB_16SPathoprobe와 DB_16SPathoREV 및 DB_16SPathoFWD의 프라이머 생성물(1059 bp)의 막 분포 및 (B) 점-블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 7: (A) 병원성 렙토스피라 혈청형의 게놈 DNA 혼합물을 사용한 DB_lipL41REV 및 DB_lipL41FWD 프라이머 생성물(479 bp)을 사용한 DB_lipL41probe의 점 블롯 분포 및 (B) 점-블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 16S 리보솜 RNA 서열을 기반으로 한 부생식물 Leptospira 종과 프라이머 및 프로브의 정렬. 프라이머는 식별을 위해 굵은 검은색으로 강조 표시되며 방향은 검은색 화살표로 표시됩니다. 프로브는 굵게 표시되고 회색으로 강조 표시되며 위치는 회색 선으로 표시됩니다. 정렬된 시퀀스는 밝은 회색으로 강조 표시되고 해당되지 않는 시퀀스는 흑백으로 강조 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 16S 리보솜 RNA 서열을 기반으로 한 프라이머 및 프로브와 중간 Leptospira 종의 정렬. 프라이머는 식별을 위해 굵은 검은색으로 강조 표시되며 방향은 검은색 화살표로 표시됩니다. 프로브는 굵게 표시되고 회색으로 강조 표시되며 위치는 회색 선으로 표시됩니다. 정렬된 시퀀스는 밝은 회색으로 표시되고 해당되지 않는 시퀀스는 흑백으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: lipL32 유전자 염기서열을 기반으로 한 병원성 Leptospira 종과 프라이머 및 프로브의 정렬. 프라이머는 식별을 위해 굵은 검은색으로 강조 표시되며 방향은 검은색 화살표로 표시됩니다. 프로브는 굵게 표시되고 회색으로 강조 표시되며 위치는 회색 선으로 표시됩니다. 정렬된 시퀀스는 밝은 회색으로 표시되고 해당되지 않는 시퀀스는 흑백으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: lipL41 유전자 염기서열을 기반으로 한 병원성 렙토스피라 종과 프라이머 및 프로브의 정렬. 식별을 위해 프라이머는 굵게 표시되고 검은색으로 강조 표시되며 방향은 검은색 화살표로 표시됩니다. 프로브는 굵게 표시되고 짙은 회색으로 강조 표시되며 위치는 회색 선으로 표시됩니다. 정렬된 시퀀스는 밝은 회색으로 표시되고 해당되지 않는 시퀀스는 흑백으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 5: 16S 리보솜 RNA 서열을 표적으로 하는 프라이머와 부생식물, 중간 및 병원성 종에 대한 프로브와 Leptospira 종의 정렬. 식별을 위해 프라이머는 굵은 글씨로 표시되고 검은 색으로 강조 표시되며 방향은 검은 색 화살표로 표시됩니다. 프로브는 굵게 표시되고 회색으로 강조 표시되며 위치는 회색 선으로 표시됩니다. 정렬된 시퀀스는 밝은 회색으로 표시되고 해당되지 않는 시퀀스는 흰색과 검은색으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 6: 도트 블롯 분석을 위한 완충액 및 용액. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

도트 블롯 기법의 중요한 단계에는 (1) DNA 고정화, (2) 비상동 DNA로 멤브레인의 자유 결합 부위 차단, (3) 어닐링 조건에서 프로브와 타겟 단편 사이의 상보성, (4) 비혼성화 프로브 제거, (5) 리포터 분자41의 검출이 포함됩니다.

PCR-도트-블롯은 특정 제한사항을 갖는데, 이를테면 이 기술은 혼성화된 단편(37)의 크기에 관한 정보를 제공하지 않고, 제2 또는 제3 프로브와의 재혼성화 전에 단일 막의 탈혼성화를 요구하며, 최종 결과까지 상당한 시간과 노력을 필요로 한다.

이 기술은 다른 분자 기술42,43 및 그 응용과의 일관성을 보여주었습니다. 역점-블롯, 나노골드 점-블롯21 및 점-ELISA42는 16S rRNA29,43을 기반으로 Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 및 Mycobacterium tuberculosis48,49와 같은 유기체의 특정 유전자 검출 및 식물의 DNA 또는 RNA 검출에 사용되었습니다 바이러스41. 이 기술(50)에 의해 일관되고 신뢰성 있게 측정할 수 있는 미생물의 가장 낮은 농도로 정의되는 검출한계(LOD)는 H. pylori47에 대한 100 pg(5 x 104 박테리아)에서 임상 샘플(45)에서 B. burgdorferi의 단일 세포 및 세포보다 작은 fg에 이르기까지, 결핵균 48,49.

이 결합된 방법론의 한 가지 중요한 측면은 (1) DNA가 충분하지 않은 샘플 또는 (2) 샘플 오염으로 인해 양성 샘플 25,45,47,48,49를 100% 검출할 수 있는 일관되지 않은 결과로 이어질 수 있는 두 가지 샘플 조건으로 인한 위음성 결과를 극복하여 검출 한계를 한 단계 확장할 수 있는 기능입니다. PCR-Dot-blot은 아가로스 겔 전기영동에서 검출할 수 있는 것보다 더 적은 양의 증폭된 제품을 검출할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 중첩 및 반중첩 PCR에서와 같이 2차 증폭 단계의 결과로 인한 오염을 방지합니다. 이러한 장점은 분자 기술을 방해할 수 있는 광범위한 억제제와 관련 없는 출처의 DNA를 포함할 수 있는 낮은 박테리아 전하를 포함하는 환경 샘플로 작업할 때 특히 중요합니다.

이전 연구에 따르면 leptospires는 5pg(5 x 103 leptospires)51의 LOD에 도달하는 광비오틴으로 표지된 DNA 프로브에 의해 식별될 수 있습니다. DIG 표지 프로브는 0.1-1pg(102 렙토스파이어)를 검출하는 반면, 32개의 P 라벨 프로브는 1-5pg(750 - 1000 렙토스파이어)를 검출하고51, 비오틴 라벨 프로브는 5pg(2500 렙토스파이어)를 검출합니다52. 또한, 부생식물 Leptospira에 대한 32개의 P 표지 프로브는 1.95ng의 LOD에 도달했으며 병원성 Leptospira에 대한 3.9ng53에 도달했습니다. 이 연구에서는 세 가지 클래드에 대해 유사한 LOD가 설정되었습니다. 병원성 종에 대한 LOD는 약 0.3ng의 게놈 DNA(6-8 x 104 GEq)였으며(그림 11), 부생식물 및 중간 종의 경우 0.1ng(2 x 104 GEq)로 떨어졌습니다. 특히, 이전 연구는 병원성 렙토스피라54,55를 검출하고 렙토스피라56의 식별 및 분류를 위한 도구로 표지된 32P와의 DNA 교잡을 적용하는 것을 목표로 실험적으로 감염된 골든 햄스터의 순수 렙토스피라 배양균(51)과 혈청을 사용하여 수행되었습니다. 이들 프로브는 높은 특이성을 나타내고 다른 미생물 19,51,54,55,56,57로부터의 비상동성 DNA와 교차-혼성화를 나타내지 않으며, Leptonema57과 같은 밀접하게 관련된 종 사이에서도 구별할 수 있다 . 마찬가지로, 이 연구에서는 비상동성 DNA와의 혼성화가 관찰되지 않았습니다. 비록 비-동위원소 프로브가 동위원소 프로브(58) 또는 다른 기술(43)만큼 민감하지는 않지만, 리슈마니아(Leishmania) 및 소 헤르페스 바이러스 4(BHV4)의 검출에서 볼 수 있듯이, PCR-도트-블롯 조합은 다른 PCR-기반 기술에 비해 민감도의 10배까지 증가를 허용할 것으로 예상할 수 있다.24,26.

반면에, 렙토스피라 식별을 위한 점-블롯 분석은 항체와 함께 더 자주 사용되었으며, 최근에는 소변 샘플에서 인간과 동물을 진단하기 위한 대안으로 단클론 항체와 함께 사용되었습니다 59,60,61,62. 이 연구에서 샘플은 사전 단계 없이 멤브레인에 직접 처리되며 항체는 발병과 관련된 특정 Leptospira 표면 단백질을 표적으로 합니다. 예를 들어, Mab-Dot-blot ELISA는 높은 민감도와 특이성을 보여 1μg의 박테리아 균질액62를 검출합니다. Mab-Dot-blot 분석에서 얻은 결과는 일반적으로 소변 약 103 leptospires/ml 또는 9.3ng의 Leptospira homogenate63 LOD를 갖는 PCR 분석과 유사할 수 있습니다. PCR로 증폭할 수 있는 게놈 DNA의 양은 100개 세포(DNA 500fg)61입니다. 이러한 이전 연구는 농축 절차 없이 순수 배양 또는 임상 샘플을 사용했으며 더 나은 진단을 지향했습니다. 감염된 쥐는 107 렙토스피레스/mL의 소변64를 배설할 수 있고, 개는 102에서 106 렙토스피레스/mL의 소변65를 배설할 수 있으며, 이는 수역의 오염원 역할을 한다는 점을 감안할 때, 환경 샘플은 렙토스피럴 농축을 필요로 합니다. 블로팅(blotting) 전에 표적 DNA의 시험관 내 PCR 증폭은 최대 10배의 절차 민감도 향상을 허용합니다52,55. 보통, 종말점 PCR에 의해 증폭된 제품은 아가로스 젤 전기영동에서 시각화되지 않을 것입니다; 그럼에도 불구하고, 이는 DOG 라벨링 프로브의 특정 하이브리드화를 통해 분명해집니다.

렙토스피라와 렙토스피라증에 대한 많은 연구가 질병 진단에 초점을 맞추고 있지만, 수역에서의 생태와 수역 내 분포에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. PCR-Dot-blot 기법은 렙토스피라와 렙토스피라증을 연구하기 위한 도구 상자에 추가되어 많은 수의 샘플을 스크리닝하고 결과 및 해석을 가속화하는 이점을 제공합니다. PCR-Dot-blot은 단일 멤브레인에 여러 프로브를 수용할 수 있는 상대적으로 저렴하고 간단하며 비방사성 기술입니다. 또한 리소스가 제한된 환경에서 어려울 수 있는 정교한 장비와 복잡한 워크플로의 필요성을 제거합니다.

이 연구의 영향은 토양, 고인 물, 배설물, 혈액 및 조직을 포함한 다른 생태학적 틈새 및 샘플 유형뿐만 아니라 다양한 깊이의 대규모 수역을 연구하는 데 향후 적용할 수 있다는 것입니다.

결론적으로, 이 작업은 Leptospira 속 내의 3개 clades를 식별하기 위해 DNA 프로브의 digoxigenin 라벨링을 기반으로 하는 PCR-Dot-blot 기술의 적용을 보여줍니다. 이 방법은 단일 증폭 단계로 줄여 식별 프로세스를 간소화하고 단일 멤브레인을 사용하여 3개의 동시 혼성화 또는 3개의 연속 혼성화를 허용합니다. 이 기법으로 달성된 검출 한계는 방사성 프로브(53)로 달성된 검출 한계와 유사하여, 자연적 공급원으로부터의 물 샘플에서 렙토스피라를 식별하는 데 유용한 도구가 된다. 결과적으로 이 기법은 최소한의 박테리아 DNA로 샘플을 평가할 때 향상된 감도를 제공하고 정확하고 일관된 결과를 제공합니다. 이는 수역에서 렙토스피라 의 역학을 연구하기 위한 대안적인 접근 방식으로 사용되며 더 광범위한 환경 샘플의 평가 및 감시를 지원하여 이 미생물의 전염에 대한 예방 조치를 구현하는 데 도움이 될 수 있습니다.

기술에 어려움이 있는 경우 다음 문제 해결 하이라이트를 고려하십시오: (1) 점의 모양이 불규칙한 경우 진공 시스템이 십자형으로 단단히 닫혀 있는지 확인한 다음 전송을 반복합니다. (2) 하룻밤 동안 혼성화 튜브가 파손되어 멤브레인이 혼성화 버퍼를 잃게 되는 경우 "탈혼성화 절차" 섹션을 참조하고 공정을 다시 시작하십시오. (3) 점이 보이지 않으면 멤브레인을 버리지 마십시오. "De-hybridization procedure" 섹션으로 진행하여 hybridization 단계를 반복합니다. (3) 현상된 X-ray 필름에서 고르지 않은 흰색 영역이 발견되면 백 밀봉 과정에서 기포가 갇히지 않도록 하십시오. (5) 현상된 X선 필름에서 고르지 않은 검은색 영역이 관찰되면 완충된 손가락을 사용하여 CSPD가 완전히 분포되었는지 확인합니다. (6) X선 필름에 점의 그림자가 보이면 노출 시간 동안 필름이 움직이지 않도록 하십시오.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

우리는 멕시코 국립 자치 대학교 (National Autonomous University of Mexico)의 수의학 및 동물 공학 학부 미생물학 및 면역학과의 렙토스피라 컬렉션에 빚을지고 있습니다. 우리는 참조 Leptospira 균주의 관대 한 기부에 감사드립니다. Leptospira fainei serovar Hurstbridge 균주 BUT6 및 Leptospira biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I에서 Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. CIBAC 코디네이터인 Dr. José Antonio Ocampo Cervantes와 직원들의 물류 지원에 감사드립니다. EDT는 Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa의 학부생을 위한 터미널 프로젝트 프로그램에 있었습니다. 우리는 그림 1과 3에서 9까지의 생성을 위한 Biorender.com 소프트웨어를 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
REAGENTS
Purelink DNA 추출 키트InvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq 중합효소 키트)PromegaM3001
Whatman 여과지, 등급 1,MerkWHA1001325
나일론 멤브레인, 양전하를 띤 롤 30cm x 3 mRoche
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibodyRoche11093274910
Medium Base EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Enrichment EMJHDifcoBD 279510
차단 시약Roche11096176001
CSPD 즉시 사용 가능 디소듐 3-(4-메톡시스피로 {1,2-디옥세탄-3,2&프라임;-(5&프라임;-클로로) 트리사이클로[3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) 페닐 포스페이Merk11755633001
청어 정자에서 추출한 디옥시리보 핵산Sigma AldrichD3159
개발자 CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
디곡시제닌-11-ddUTP로슈11363905910
EDTA, 디소듐 염 (이수화물)프로메가H5032
피콜 400시그마 알드리치F8016
정착액 케어스트림 케어스트림 헬스 IncGBX 5158605
라우릴 설페이트 나트륨 염 (소듐 도데실 설페이트; SDS) C12H2504SNa시그마 AldrichL5750
N-라우로일사르코신 나트륨 염 CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa시그마 AldrichL-9150음이온 성 계면 활성제입니다
Polivinylpyrrolidone (PVP-40),Sigma AldrichPVP40
폴리에틸렌 글리콜, 소르 비탄 모노 laurate (트윈 20),Sigma Aldrich9005-64-5
염화나트륨 (NaCl),Sigma Aldrich7647-14-5
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS), Sigma Aldrich151-21-3
수산화 나트륨 (NaOH)시그마 알드리치1310-73-2
인산 나트륨 이염기성 (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
말단 전이 효소, 재조합Roche3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1L다음과 같이 집에서 만들 수 있습니다. 보충 파일 6
프라이머Sigma-Aldrich수요에 따라표 1
프로브를 따르세요.Sigma-Aldrich수요에 따라표 1
을 따르세요Equipment
Nanodrop™ 분광 광도계1 개 Thermo-ScientificND-ONE-W
냉장 마이크로 원심 분리기 Sigma 1-14K, 14,000 rpmSigma-Aldrich1-14K
소독 조절 가능한 피펫, 범위 2-20 µ에서 1.5ml 마이크로 원심 분리기 튜브의 원심 분리에 적합; l, 20-200 &마이크로; lGilsonSKU : F167360
일회용 1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브 (오토 클레이브)AxygenMCT-150-SP
일회용 600 µ l 마이크로 원심 분리기 튜브 (오토 클레이브)Axygen3208
일회용 피펫 팁 1-10 µ lAxygenT-300
일회용 피펫 팁 1-200 &마이크로; lAxygenTR-222-Y
도트 블롯 장치 Bio-DotBIORAD1706545
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