여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
대두(Glycine max)는 수천 가지 산업적 용도를 가진 농업에서 귀중한 작물입니다. 콩 뿌리는 질소와 병원균을 고정하기 위해 공생을 형성하는 토양 매개 미생물과의 주요 상호 작용 부위이며, 이는 농업 생산을 개선하기 위해 콩 뿌리 유전학과 관련된 연구를 가장 중요하게 만듭니다. 대두 털 뿌리(HR)의 유전적 변형은 Agrobacterium rhizogenes 균주 NCPPB2659(K599)에 의해 매개되며 처음부터 끝까지 단 2개월이 소요되는 대두 뿌리의 유전자 기능을 연구하는 데 효율적인 도구입니다. 여기에서 우리는 대두 HR에서 관심 유전자를 과발현하고 침묵시키는 방법을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법론에는 대두 종자 살균, 자엽의 K599 감염, RNA 분리를 위한 유전자 변형 HR의 선택 및 수확, 그리고 필요한 경우 대사산물 분석이 포함됩니다. 이 접근법의 처리량은 여러 유전자 또는 네트워크를 동시에 연구하기에 충분하며 장기적으로 안정적인 형질전환 접근법을 도입하기 전에 최적의 엔지니어링 전략을 결정할 수 있습니다.
서론
대두(Glycine max)는 농업에서 가장 가치 있는 작물 중 하나입니다. 그것은 식품, 동물 사료, 기름과 같은 수천 개의 상업 및 산업 용도를 가지고 있으며 제조 원료의 원천으로사용됩니다 1. 질소 고정 토양 미생물, 즉 근경(rhizobia)과 공생 관계를 형성하는 능력은 대두 유전학 연구의 중요성을 더욱 높인다2. 예를 들어, 콩 뿌리의 질소 고정 특성을 미세 조정하면 탄소 배출량을 줄이고 질소 비료에 대한 요구량을 크게 줄일 수 있습니다3. 따라서 특히 콩 뿌리 생물학의 측면을 제어하는 유전학을 이해하는 것은 농업과 산업 분야에서 광범위하게 응용됩니다. 이러한 이점을 고려할 때 대두 유전자의 기능을 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 갖는 것이 중요합니다.
Agrobacterium tumefaciens는 많은 식물 종의 핵 게놈에 전달 DNA(T-DNA)를 통합할 수 있는 능력이 있기 때문에 식물 유전자 변형에 가장 일반적으로 사용되는 도구일 것입니다. 아그로박테리움이 식물을 감염시키면 종양 유도(Ti) 플라스미드를 숙주 염색체로 전달하여 감염 부위에 ....
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프로토콜
알림: 모든 진행 단계는 무균 상태에서 수행하는 것이 좋습니다.
1. 콩 종자 살균
- 생물 안전 캐비닛에 16-20개의 둥근 Williams 82 대두 종자를 50mL 원심분리기 튜브에 깨끗한 상태(즉, 균열이나 흠집 없음)로 넣습니다.
- 70% 이소프로필 알코올 30mL를 넣고 30초 동안 부드럽게 흔든 다음 알코올을 디캔팅합니다.
- 씨앗을 10% 표백제 30mL로 10초 동안 부드럽게 흔들고 씨앗을 실온(RT, 25°C)에서 5분 동안 용액에 그대로 둡니다. 5분 후 표백제를 배출합니다.
- 헹굼 당 1분 동안 멸균된 초순수 H2O 30mL로 진탕을 3회 반복하고 각 헹굼 사이에H2O를 버립니다.
- 멸균된 종자를 5mL의 발아 및 공동 재배(GC) 배지(오토클레이브 절반 강도 액체 Murashige 및 Skoog[MS] 배지에 1% 자당[pH = 5.8]로 포화시킨 다음 2.5mL/L 비타민)를 멸균된 페트리 접시에 넣습니다.
- 플레이트를 RT(25°C)의 어두운 곳에 3일 동안 두었다가 22°C에서 16시간 동안 차가운 흰색 T5 형광등(100μE m-2·s-1
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결과
대표적인 결과는 발표 된 데이터19,20에서 나온 것입니다. 형질전환된 K599 아그로박테리움의 콜로니 PCR(cPCR) 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 양성 콜로니에 의해 나타난 바와 같이, 관심있는 유전자는 cPCR에 의해 검출되었다 (도 1A). 그러나 콜로니의 1/3 내지 1/2은 VirD2 유전자 스크리닝에 대해 음성이었고(그림 1B), 이는 Ti 플라스미드의 손실을 나타내며 캘러스 또는 털이 많은 뿌리를 생성할 수 없습니다. 도 2는 대두 HRs의 전체 제조 절차 및 유전자 발현 분석을 나타낸 것이다.
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토론
지난 10년 동안 대두 HR 방법은 질소 고정 22,23, 생물학적 및 비생물적 스트레스 내성 24,25, 대사 산물 생합성 경로 26,27에 관여하는 유전자를 연구하는 강력한 도구로 개발되었습니다. 식물이 대사 산물을 생산하는 방법에 대한 지식은 병원체에 대한 생화학적 방어를 매개하는 유전자 네트워크를 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 농업 생산과 제약 산업에 많은 이점이 있습니다28.
생산성과 비용 효율성을 우선시하기 위해 이 프로토콜은 절차를 단순화합니다. 예를 들어, 겔화제를 함유한 더 비싼 고체 배지를 사용하는 대신.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) 보조금 번호 RGPIN-2020-06111과 Brad Lace의 관대한 기부로 자금을 지원받았습니다. K599 아그로박테리움 및 예비 프로토콜에 대해 Wayne Parrott (University of Georgia)에, pGWB2, pGWB6 및 pANDA35HK 빈 벡터에 대해 Nakagawa & Hachiya 연구실 (Shimane University)에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토시링곤 | 케이맨 | 23224 | |
| 표백제 | lavo | 21124 | |
| DMSO | 피셔 생물 시약 | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| 이소프로필 알코올 | Fisher 화학 | 물질 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB 분말 | Fisher 생물 시약 | 200318 | |
| MS 분말 | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher 생물 시약 | 194171 | |
| NaCl | Fisher 화학 | 192946 | |
| 페트리 접시 | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| 포스피노트리신 | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR 키트 | 시그마 | R4775 | |
| 수크로오스 | 바이오샵 | 2D76475 | |
| 티멘틴 | 케이슨 랩스 | 12222002 | |
| 비타민 | 케이슨 랩스 | 2211010 |
참고문헌
- Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria ....
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재인쇄 및 허가
