여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화
이 논문에서
요약
초록
스페로이드의 3차원(3D) 캡슐화는 최적의 세포 성장을 위해 종양 미세환경을 적절하게 복제하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 종양 세포외 미세환경을 모방하기 위해 스페로이드 캡슐화를 위한 시험관 내 3D 교모세포종 모델을 설계했습니다. 먼저, 폴리디메틸실록산을 사용하여 정사각형 피라미드형 마이크로웰 몰드를 형성했습니다. 그런 다음 이 마이크로웰 몰드를 사용하여 50-500μm의 엄격하게 제어된 크기의 종양 스페로이드를 제작했습니다. 스페로이드가 형성되면 수거하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 하이드로겔에 캡슐화했습니다. PEG 하이드로겔은 스페로이드 캡슐화를 위한 다목적 플랫폼으로, 강성, 분해성 및 세포 접착성과 같은 하이드로겔 특성을 독립적으로 조정할 수 있습니다. 여기서는 대표적인 연화(~8kPa) 하이드로겔을 사용하여 교모세포종 스페로이드를 캡슐화했습니다. 마지막으로, 스페로이드를 염색하고 이미지화하는 방법이 개발되어 컨포칼 현미경을 통해 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 조밀한 스페로이드 코어와 상대적으로 희박한 주변부로 인해 이미징이 어려울 수 있지만 투명화 용액과 공초점 광학 절편을 사용하면 이러한 이미징 어려움을 완화하는 데 도움이 됩니다. 요약하면, 균일한 스페로이드를 제조하고, PEG 하이드로겔에 캡슐화하고, 캡슐화된 스페로이드에 대해 공초점 현미경을 수행하여 스페로이드 성장 및 다양한 세포-기질 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다.
서론
종양 스페로이드는 암 병인학, 병리학 및 약물 반응성을 연구하는 데 유용한 시험관 내 도구로 부상했습니다1. 전통적으로 스페로이드는 저접착 플레이트 또는 바이오리액터와 같은 조건에서 배양되어 왔으며, 세포 표면 접착보다 세포간 접착이 선호됩니다2. 그러나 이제 종양 미세환경을 보다 충실하게 재현하기 위해 시험관 내 스페로이드 모델은 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 모두 캡처해야 한다는 것이 인식되었습니다. 이로 인해 여러 그룹이 스페로이드를 캡슐화할 수 있는 하이드로겔과 같은 스캐폴드를 설계하게 되었습니다 3,4. 이러한 하이드로겔 기반 스페로이드 모델은 생존율, 증식, 줄기성 또는 치료 반응성과 같은 다양한 세포 거동에 대한 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 규명할 수 있습니다3.
여기서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 하이드로겔에서 교모세포종 스페로이드를 캡슐화하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 하이드로겔의 교모세포종 세포 스페로이드 캡슐화에 대한 여러 문헌 보고가 있습....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 솔루션 준비
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 전구체 용액의 제조
- 네거티브 PDMS 전구체 용액(접착제 전구체 용액에도 사용됨)을 준비합니다. 주걱을 사용하여 엘라스토머를 계량 보트에 퍼서 무게를 잰다. 경화제를 엘라스토머 베이스에 1:10 비율로 추가합니다. 플라스틱 계량 보트의 주걱을 사용하여 PDMS와 경화제를 부드럽고 완전히 혼합합니다.
알림: 이 PDMS 전구체 용액을 6웰 정사각형 피라미드 마이크로웰 플레이트에 부어 네거티브 몰드를 형성합니다. 이것은 접착제 전구체 용액에 사용되는 것과 동일한 용액입니다. - 포지티브 PDMS 전구체 용액을 준비합니다. 주걱을 사용하여 엘라스토머 베이스를 계량 보트에 퍼서 무게를 잰다. 경화제를 엘라스토머 베이스에 1:9 비율로 추가합니다. 플라스틱 계량 보트의 주걱을 사용하여 PDMS와 경화제를 부드럽고 완전히 혼합합니다.
참고: 이 PDMS 전구체 용액은 나중에 음극 금형에 부어 양극 금형을 형성합니다.
- 네거티브 PDMS 전구체 용액(접착제 전구체 용액에도 사용됨)을 준비합니다. 주걱을 사용하여 엘라스토머를 계량 보트에 퍼서 무게를 잰다. 경화제를 엘라스토머 베이스에 1:10 비율로 추가합니다. 플라스틱 계량 보트의 주걱을 사용하여 PDMS와 경화제를 부드럽고 완전히 혼합합니다.
- pH 8의 0.3M 트리에탄올아민(TEA) 완충액 제조
- 피펫 보조제를 사용하여 1mL의 TEA와 9mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 50mL 원뿔형에 피펫팅하여 0.75M TEA 용액을 만듭니다. 1....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
화학 요법 효과를 연구하기 위한 스페로이드 기반 약물 스크리닝 플랫폼은 자연 조직을 복제하는 생체 재료에서 스페로이드 캡슐화 시 종양 미세환경을 조절하는 데 중점을 두기 때문에 점점 더 많은 수요가 증가하고 있습니다. 여기에서 우리는 다세포 종양 스페로이드 제제와 3D 하이드로겔에서의 후속 캡슐화 및 이미징을 위한 방법을 개발했습니다. 스페로이드는 마이크로웰 몰드(그림 3A,B)에서 준비되며, 그 결과 구형과 엄격하게 제어된 다분산성을 가진 스페로이드가 생성됩니다. 예를 들어, 마이크로웰당 3,300개의 세포가 있는 스페로이드의 경우 평균 스페로이드 크기는 ~250μm이고 원형도는 >0.8이며, 여기서 1은 완벽한 구입니다(그림 3C,D). 스페로이드 직경에 대한 백분율 분산 계수(%CV)는 19.3%이고 원형도에 대한 %CV는 4.5%였습니다. 스페로이드 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
하이드로겔 기반 다세포 종양 스페로이드 모델은 암 치료 발견을 발전시키기 위해 점점 더 많이 개발되고 있습니다 11,13,29. 이 모델은 통제된 방식으로 종양 미세환경의 주요 파라미터를 모방하고, 복잡성에도 불구하고 in vivo 모델보다 사용이 간단하고 저렴하며, 많은 모델이 고처리량 스크리닝 기술과 호환되기 때문에 유용합니다. 하이드로겔 생체 재료는 종양 세포외 기질을 모방하고 세포-기질 상호작용을 촉진하도록 조정할 수 있으며, 스페로이드(해리된 세포와 반대)는 본래 종양의 세포-세포 상호작용을 모방합니다. 합성 하이드로겔은, 여기에서 입증된 바와 같이, 하이드로겔이 원하는 구조적 지지체와 물리적 및 기계적 특성을 제공하는 반면, 접착 리간드 또는 분해성 서열을 사용하여 생화학적 물질 특성을 독립적으로 조정할 수 있기 때문에 특히 유리합니다. 합성 하이드로겔.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 세인트루이스 대학교가 실비야 P 주스티악 박사에게 제공한 창업 자금과 세인트루이스 대학교의 헨리 앤 아멜리아 나스랄라 신경과학 센터(Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience)가 실비야 P 주스티악 박사에게 수여한 시드 그랜트로 자금을 지원받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 70% 에탄올 | 피셔 사이언티픽 | LC22210-4 | |
| 15mL 원뿔 | FALCON | 352097 | |
| 24웰 플레이트 초저 부착 플레이트 | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| 35mm 페트리 접시 | 아마존 | 706011 | |
| 4-암 폴리(에틸렌 글리콜)-아크릴레이트(4-암 PEG-Ac, 10kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50mL 원뿔형 | Fisher Scinetific | ||
| 6-웰 AggreWell 400 | StemCell Technologies, 밴쿠버, 캐나다 | 34421 | 정사각형 피라미드 형 마이크로 웰 |
| 접착 방지 헹굼 솔루션 | StemCell Technologies, 밴쿠버, 캐나다 | Cat #: 07010 | |
| 아스파르트산-아르기닌-시스테인-글리신-발린-프롤린-메티오닌-세린-메티오닌-아르기닌-글리신-시스테인-아르기닌-아스파르트산(DRCG-VPMSMR-GCRD) 펩타이드 | Genic Bio, 상하이, 중국 | n/a | 맞춤형 합성 |
| 화학 흄 후드 | KEWAUNEE | 99151 | |
| 코닝 마트리겔 베이스먼트 멤브레인 매트릭스, LDEV Free | Corning | 356234 | 기저막 매트릭스 |
| 세제 - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | 비이온성 계면활성제 |
| 디메틸설폭시드 (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| 일회용 피펫 (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| 소 태아 혈청 | HyClone | SH30073-03 | |
| 포름알데히드 37% 용액 | Sigma Aldrich | F1635 | |
| 유리판 | 슬럼피 | GBS4100SFSL | |
| 유리 전사 피펫 | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| 글리신-아르기닌-시스테인-아스파르트산-아르기닌-글리신-아스파르트산-세린(GRCD-RGDS) 펩타이드 | Genic Bio, 상하이, 중국 | n/a | 맞춤형 합성 |
| 혈구계 | Bright-Line | 383684 | |
| 소수성 솔루션 - Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| 인큐베이터 | NUAIRE | NU-8500 | |
| 도립 현미경 (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific | D1125 | |
| 라이카 컨포칼 SP8 | 라이카 마이크로시스템즈 Inc. | ||
| 빛 및 형광 현미경 (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| 현미경 소프트웨어 | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-23927 | |
| 파라 필름 | 파라 필름 | PM992 | |
| PBS(1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | MP Biomedicals | 1670046 | |
| 피펫 에이드 | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| 피펫 팁 (1– 200 &마이크로; L, 101– 1000 &마이크로; L) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| 플라스틱 표준 일회용 전송 피펫 | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| 플라스틱 무게 보트 (100 mL) | 아마존 | MDO-AZOC-1030 | |
| 폴리(에틸렌 글리콜)-디티올(PEG-DISH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| 폴리디메힐실록산(PDMS) [Slygard 182 엘라스토머 키트] | Elsworth 접착제 | 3097358-1004 | 폴리디메틸실록산 |
| 분말 무료 검사 장갑 | Quest | 92897 | |
| Propidium iodide, 1 mg/mL 수용액. | 피셔 사이언티픽 | ||
| RPMI-1640 중간 (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| 실리콘 스페이서 - 실리콘 시트, 0.5 mm 두께/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| 조직 배양 후드 | NUAIRE | NU-425-600 | |
| 트리에탄올아민, ≥ 99.0%(GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG 인간 교모세포종 세포 | 미국형 배양 컬렉션 | 증권 시세 표시기 - 14 |
참고문헌
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
