의약품(DP)에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 농축하고 단백질체 농축 비드를 사용하여 펩타이드를 검출하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 자체 제조한 단클론 항체(mAb) 원료의약품(DS)을 사용하여 시연되며, 이는 성능 측면에서 다양한 방법을 평가하고 비교하기 위한 잘 특성화된 표준 물질입니다.
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이 논문에서
요약
초록
숙주 세포 단백질(HCP)은 소량이라도 치료용 단백질에 악영향을 미칠 수 있는 불순물입니다. 의약품과 관련된 잠재적 위험을 평가하기 위해 저농도 HCP를 식별하는 방법이 개발되었습니다. 민감한 HCP 검출 방법을 개발하기 위한 중요한 접근법은 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 활용하여 분석 전에 단클론 항체(mAb)를 제거하는 동시에 HCP를 농축하는 것입니다.
이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하여 숙주 세포 단백질을 농축하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. 이 비드에는 다양한 단백질에 대한 특정 친화력을 가진 다양한 헥사펩타이드 리간드 라이브러리가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 또한 나노 LC-MS/MS를 사용하여 제한된 분해 및 후속 펩타이드 검출을 통합합니다. 이러한 기술을 사용하면 존재비가 낮은 HCP를 7,000배 이상 농축할 수 있으며, 그 결과 0.002ppm의 놀라운 검출 한계를 달성할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜을 통해 NIST mAb를 사용하여 높은 수준의 신뢰도로 850개의 HCP를 검출할 수 있다는 것입니다. 또한 사용자 친화적으로 설계되었으며 구현을 지원하는 비디오 데모가 포함되어 있습니다. 이러한 단계를 수행함으로써 연구자들은 HCP를 효과적으로 농축하고 검출하여 의약품에 대한 위험 평가의 민감도와 정확성을 향상시킬 수 있습니다.
서론
숙주 세포 단백질(HCP)은 숙주 유기체의 세포 배양에서 방출되고 단클론 항체(mAb)1,2,3,4와 함께 공동 정제되는 불순물입니다. HCP의 미량 수준은 의약품 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 ppm 미만에서 ppm 수준의 HCP를 검출하기 위해 민감한 HCP 분석 방법이 필요합니다.
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프로토콜
프로토콜에 사용된 약어는 보충 표 1에 나열되어 있습니다.
1. 용액 및 완충액의 준비
알림: 모든 시약의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
- 유리 바이알에 8.0 M Tris-HCl, pH 1 1mL의 탈 이온수, pH 8.0을 첨가하여 pH 8.0 M Tris-HCl, pH 9 용액을 준비하고 소용돌이 치면서 잘 혼합합니다. 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.
- 24M Tris-HCl, pH 10.1mL에 SDC 1mg을 용해시켜 8.0mM 나트륨 데 옥시 콜 레이트 (SDC)를 준비합니다.
- 24 M Tris-HCl, pH 7의 1 mL에 SLS의 0.1 mg을 용해시켜 8.0 mM 나트륨 라 우로 일 사르코 시 네이트 (SLS)를 준비합니다.
- 24mM SDC와 24mM SLS를 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 용출 버퍼를 준비합니다.
- 50μg의 트립신에 400μL의 탈이온수를 추가하여 20ng/μL의 트립신 용액을 준비합니다.
- 25 mg / mL 디 티 오 트레이 톨 (D....
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결과
이 프로토콜은 단클론 항체(mAb) 샘플에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 분석하기 위해 제한된 분해(PMLD)와 결합된 단백질 농축(protein enrichment)이라고 하는 샘플 전처리 워크플로우를 제시했습니다. 그림 1 은 PMLD의 단계별 절차를 보여줍니다. 연구원들은 직접 분해( 그림 2의 상단 패널에 표시)와 PMLD( 그림 2의 하단 패널에 표시)를 사용한 HCP 분석 결과를 비교했습니다. 총 이온 크로마토그램(TIC) 프로파일은 PMLD가 주요 mAb 펩타이드를 현저히 감소시키거나 제거하면서 mAb 펩타이드에 필적하는 일부 HCP 펩타이드를 관찰할 수 있음을 나타냅니다. 나노 LC(표 1) 및 MS/MS(표 2) 분석에 대한 자세한 파라미터가 제공됩니다. 또한 표 3
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토론
시판되는 단백질 농축 비드에는 두 가지 버전이 있습니다: 하나는 더 작은 용량이고 다른 하나는 더 큰 용량입니다( 재료 표 참조). 두 가지 버전의 농축 비드에는 패키지에 10개의 프렙이 포함되어 있습니다. 제조업체의 지침에 따르면 소용량 키트의 각 준비는 총 단백질 10mg을 농축하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DS에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농축을 최적으로 수행하려면 각 분취를 5개의 DS 샘플에 사용하는 것이 좋습니다. 따라서 각 키트를 사용하여 50개의 샘플에서 HCP를 농축할 수 있습니다. 대용량 키트의 각 분취에 대해 25개의 DS 검체에서 HCP를 농축하는 데 적합하며, 총 250개의 검체에서 HCP를 검출할 수 있습니다.
3.1단계에서는 전체 프로토콜에서 재사용되므로 상단 또는 하단 대문자를 버리지 않는 것이 좋습니다. 비드가 상단 캡에 가라앉으면 하단 플러그를 제거하고 상단 캡을 컬럼에 유지한 상태에서 원심분리한 후 교체하십.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 16 G, 메탈 허브 니들, 2 인치, 포인트 스타일 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 트랩 컬럼 (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛 | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 분석 컬럼 (0.075 mm × 1.7 μ m &시간; 30cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| 사내 mAb | 리제네론 | 농도 200mg/mL | |
| 요오드아세트아미드(30 x 9.3mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| 이소프로판올 | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-히스티딘 | 시그마 알드리치 | H6034 | |
| L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 일수화물 | 시그마 알드리치 | 53370 | |
| 메탄올 | 피셔 - 사이언티픽 | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer 소프트웨어 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20ug) | Promega | V5111 | |
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| UltiMate 3000 RSLC 나노 시스템 | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| 물 0.1% 포름산 (v/v), Optima LC/MS 등급 | 피셔-사이언티픽 | LS118-4 |
참고문헌
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C.
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