RGBradford: 스마트폰 카메라를 이용한 단백질 정량 분석

요약

이 논문은 Bradford 분석과 스마트폰을 분석 장치로 사용하여 단백질 정량화를 위한 프로토콜을 제공합니다. 샘플의 단백질 수준은 스마트폰으로 촬영한 마이크로플레이트 사진에서 추출한 색상 데이터를 사용하여 정량화할 수 있습니다.

초록

단백질 정량 분석은 생명 과학 연구에서 필수적인 절차입니다. 다른 여러 방법 중에서 Bradford 분석은 가장 많이 사용되는 방법 중 하나입니다. 널리 퍼져 있기 때문에 Bradford 분석의 한계와 장점은 성능을 개선하기 위해 원래 방법의 몇 가지 수정을 포함하여 철저하게 보고되었습니다. 원래 방법의 변경 사항 중 하나는 스마트폰 카메라를 분석 도구로 사용하는 것입니다. 이 논문은 Bradford 분석의 조건에 존재하는 세 가지 형태의 Coomassie Brilliant Blue 염료를 활용하여 마이크로플레이트의 단일 사진에서 추출한 색상 데이터를 사용하여 샘플의 단백질을 정확하게 정량화하는 방법을 설명합니다. 마이크로플레이트에서 분석을 수행한 후 스마트폰 카메라를 사용하여 사진을 촬영하고 무료 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 사진에서 RGB 색상 데이터를 추출합니다. 그런 다음 단백질 농도를 알 수 없는 샘플의 청색 대 녹색 강도 비율(RGB 척도)을 사용하여 표준 곡선을 기반으로 단백질 함량을 계산합니다. RGB 색상 데이터를 사용하여 계산된 값과 기존 흡광도 데이터를 사용하여 계산된 값 사이에는 유의미한 차이가 관찰되지 않습니다.

서론

다운스트림 사용(예: ELISA, 효소 역학, 웨스턴 블로팅, 단백질 정제 및 질량 분석법)에 관계없이 단백질 정량화는 생명 과학 실험실의 정확한 분석에 매우 중요합니다. 2차 판독(즉, 단백질 질량당 분석물의 상대적 수준을 계산하기 위해)으로 사용하는 것 외에도 샘플의 단백질 수준은 원하는 출력 자체가 될 수도 있습니다. 예를 들어, 음식물 자원¹ 또는 소변2의 단백질 수치에 관심을 가질^{수 있다. 직접 UV} 흡광도 판독 값⁴, 단백질-구리 킬레이트화 ^5,6, 단백질 염료 결합 비색 분석⁷ 및 단백질 염료 결합 형광 분석⁸을 포함하여 샘플3에서 단백질 농도를 측정하는 데 사용할 수 있는 많은 방법이 있습니다. 단백질 정량의 관련성은 가장 많이 인용된 문헌 ^9,10의 상위 3개 문헌에 단백질 측정 방법 ^5,7

프로토콜

1. Bradford 단백질 분석 시약의 준비

1. Coomassie Brilliant Blue G 100mg을 50mL 95%(w/v) 에탄올에 녹입니다. 쿠마시 브릴리언트 블루 G가 완전히 녹을 때까지 섞는다.
   주의 : 에탄올은 가연성이며 눈에 자극을 일으킵니다. 화염을 피하고 고글을 사용하십시오.
2. 이전 용액에 100mL의 85%(w/v) 인산을 조심스럽게 첨가합니다.
   주의 : 인산은 금속을 부식시키며 피부 부식, 심각한 눈 손상 및 급성 경구 독성을 유발합니다. 장갑과 고글을 착용하십시오.
3. Coomassie Brilliant Blue G, 에탄올 및 인산이 포함된 용액을 탈이온수 600mL에 천천히 추가합니다.
4. 용액을 최종 부피 1,000mL로 희석합니다. 분석할 샘플 수에 따라 확장 또는 축소합니다. 본래의 방법⁷에 기술된 바와 같이, 작용 브래드포드 시약의 최종 농도는 0.01%(w/v)의 쿠마시 브릴리언트 블루 G, 4.7%(w/v)의 에탄올, 및 8.5%(w/v)의 인산이어야 한다.
5. 여과지(Whatman #1 용지 또는 이와 동등한 용지)를 통해 여과되는 불용성 물질을 제거합니다.
6. 시약은 실온(R....

결과

도 4는 컬러 데이터를 추출하고 450nm 및 590nm에서 흡광도를 기록한 마이크로플레이트의 그림입니다. 여기에 대표로 보고된 RGB 색상 데이터는 섹션 5에 설명된 대로 자동으로 얻은 것입니다. 색 데이터의 일반적인 패턴은 파란색 값이 증가하고 빨간색과 녹색 값이 감소하는 것입니다(그림 5). 모든 웰에서 반사가 뚜렷하고 마이크로플레이트가 완벽하게 정렬되지 않았음에도 불구하고(그림 4), 그림에서 추출된 색상 데이터는 흡광도 판독값을 정확하게 반영합니다(그림 6). 또한 흡광도 판독값과 색상 데이터 모두에 대한 시료 희석과 신호 사이에는 선형 관계가 있습니다(그림 7). 이러한 대표 결과를 위해, 앞서 기술한 바와 같이 제조된 BV-2 세포 용해물(B001) 및.......

토론

이 논문은 스마트폰 카메라를 사용하여 Bradford 단백질 분석의 데이터를 기록하고, 색상 데이터를 추출하고, 최근²⁰년에 설명된 대로 생물학적 샘플의 단백질 수준을 정확하게 정량화하는 방법인 RGBradford에 대해 설명합니다. 본래의 RGBradford 방법과의 한 가지 차이점은 여기서는 ImageJ 플러그인(²² )을 사용하여 색상 데이터를 자동으로 획득하는 절차가 사용되었다는 것이다. RGBradford 방법의 주요 참신함은 RGB 데이터를 분석 신호로 사용한다는 것입니다. 따라서 Coomassie Brilliant Blue G를 사용하여 단백질 측정을 위해 실험실에서 사용되는 모든 일상적인 프로토콜을 사용한 다음 사진을 찍고 색상 데이터를 추출할 수 있습니다. 즉, 프로토콜의 1-3단계는 주어진 실험실에서 사용되는 일반적인 절차에 따라 수정될 수 있습니다. 원래 Bradford 단백질 분석의 여러 변형이 존재한다는 점을 감안할 때 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플랫 바텀 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트	Jet Biofil, 광저우, 중국	TCP011096	광학 판독 기능이 있는 모든 평평한 바닥 마이크로플레이트 부품으로 충분합니다.
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
에틸 알코올
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	카메라가 장착된 다른 스마트폰으로 대체 가능
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
인광 산성	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 울트라	삼성		해당 없음
SpectraMax 384 플러스. 마이크로플레이트 리더.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	450nm 및 590nm에서 판독할 수 있는 모든 마이크로플레이트 리더가 작동합니다. 이는 선택 사항입니다. 이 방법은 실제로 마이크로플레이트 리더의 필요성을 없애기 위해 만들어졌습니다.