방법 논문

형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

DOI:

10.3791/65560

⸱

2023년 10월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

초록

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키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 종양학의 최전선에 있습니다. CAR은 표적 도메인(일반적으로 단일 사슬 변수 단편, scFv)으로 구성되며, 동반되는 사슬 내 링커와 힌지, 막관통 및 늑골 도메인이 뒤따릅니다. 사슬 내 링커(intra-chain linker)와 힌지 도메인(hinge domain)의 변형은 CAR 매개 사멸에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. CAR 구성의 각 부분에 대한 다양한 옵션을 고려할 때 많은 수의 순열이 있습니다. CAR-T 세포를 만드는 것은 시간과 비용이 많이 드는 공정이며, 많은 구조를 만들고 테스트하는 것은 많은 시간과 재료 투자입니다. 이 프로토콜은 Jurkat 세포(CAR-J)에서 힌지 최적화 CAR 구조를 신속하게 평가하기 위한 플랫폼을 설명합니다. Jurkat 세포는 렌티바이러스 흡수율이 높은 불멸화된 T 세포주로, 효율적인 CAR transduction이 가능합니다. 여기서는 형광 이미저를 사용하여 CAR-J를 신속하게 평가한 후 PBMC 유래 T 세포의 세포 용해를 확인할 수 있는 플랫폼을 제시합니다.

서론

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미국 국립암연구소(National Cancer Institute)가 발표한 바에 따르면, CAR-T 세포 치료제는 2017년 이후 FDA가 승인한 6개의 CAR-T 제품에서 분명하게 드러나는 혈액 악성 종양에 대한 큰 가능성을 보여주었습니다1. 고형 종양을 표적으로 하는 수많은 CAR-T 세포가 임상시험에 참여하고 있습니다. 새로운 CAR 표적을 엔지니어링하고 CAR 구조를 최적화하는 것은 CAR-T 세포의 효능에 매우 중요합니다. 종양 관련 항원(TAA)을 정확하게 표적화하는 동시에 정상 조직에서 낮은 수준의 TAA 발현을 피하기 위해서는 각 응용 분야에 이상적인 CAR 구조를 선택하는 것이 필수적이다2.

CAR 구조체는 주로 5개의 구획으로 이루어진다: (1) 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 단일사슬 가변 단편(scFv) 도메인; (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; (4) 세포내 세포질 T 세포 늑골 도메인; 및 (5) 신호 영역. 이러한 각 도메인의 변형은 표적 셀3과 결합하는 CAR-T 셀의 정밀도에 영향을 미칩니다. 따라서 in vitro에서 이러한 CAR 구조체의 세포 독성 및 ....

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프로토콜

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알림: 모든 세포 배양 작업은 실험실 가운, 장갑 및 표준 무균 기술에 따라 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

1. Jurkats를 발현하는 CAR 생성 (CAR-J)

  1. Jurkat 세포를 구입하고 ATCC에서 E6-1을 복제하십시오. T-75 플라스크에서 1 x 106 세포를 해동하고 T-75 플라스크에서 배양합니다. 5 % CO2 의 37 ° C에서 10 % FBS가 보충 된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지를 사용하여 mL 당 0.6 x 106 세포로 현탁액으로 유지합니다.
  2. 플레이트 1 x 105 Jurkat 세포는 렌티바이러스 효율을 향상시키는 4μg/mL 폴리브렌을 함유한 500μL의 RPMI 성장 배지에 처리된 조직 배양 웰당 24웰 플레이트를 처리합니다. 레이저 기반 형광 검출 벤치탑 세포 분석기를 사용하여 세포 계수를 계산합니다. 웰의 수는 평가할 구성의 수에 따라 달라집니다. 이 예제에서는 4개의 구문과 변환되지 않은 컨트롤을 사용합니다. CAR 구조 설계는 표 1에 나타내었다.
  3. 각 CAR 구조체의....

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결과

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CAR-J1에 대한 1:8 및 8:1 사이의 E:T 비율 범위는 TNBC MDA-MB-231 세포에서 EGFR을 표적으로 하는 72시간에 평가되었습니다. jurkat 세포를 폴리브렌이 포함된 CAR 렌티바이러스로 형질도입하여 단계 2에 설명된 대로 CAR-J 세포를 생성했습니다. CAR-J1의 세포독성은 E:T 비율이 높을수록 유의하게 증가했으며, 1:8 비율에서 사멸 차이는 없었습니다(그림 1). 72시간 동안 4:1 E:T에서 50% 이상의 사멸이 관찰되었습니다. 이 E:T는 여러 CAR 작제물의 신속한 세포 독성 평가를 위해 지속 시간을 48시간으로 단축한 후속 실험에 사용되었습니다. 힌지 도메인이 변형된 CAR 구조체를 표적으로 하는 EGFR을 설계하였다(표 1). 사용되는 4가지 다른 경첩은 여기에 설명된 대로 IgG 길이, IgG 중간, IgG 단락 및 CD8a입니다13. 이들 3개의 작제물<.......

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토론

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여기에서 우리는 Jurkat 세포에서 CAR 발현에 의해 유도된 표적 특이적 세포 용해 활성을 효율적으로 평가할 수 있는 신속한 방법을 제안했습니다. 모든 CAR 구조체는 동일한 scFv를 갖지만 CAR-T 세포 효능에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 힌지 및 막관통 도메인이 다릅니다13. 이들 CAR-J에 의한 비특이적 사멸에 대한 추가 평가는 항원 녹아웃(KO) 세포로 배양하여 수행되었습니다. 이는 사멸이 종양 항원 특이적이며 CAR-J에 의한 기저 활성화에 의한 것이 아님을 보여줍니다. 다양한 E:T 비율의 세포독성 가능성을 쉽게 측정하여 특정 시점에서 종양 세포를 제거하는 데 필요한 최소 수의 effector cell을 식별할 수 있습니다. 동일하거나 상이한 암 유형 및 정상 세포의 여러 세포주를 사용하여 이러한 구성물의 특이성을 평가할 수도 있습니다. CAR-J 플랫폼으로 식별된 가장 강력한 후보 물질은 PBMC 유래 CD3 T 세포에서 CAR을 발현하고 유사한 사멸 분석을 수행하.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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MDA-MB-231은 셰인 스테클라인 박사의 친절한 선물이었습니다. 저자들은 이 연구를 수행하기 위해 캔자스 대학 암 센터(University of Kansas Cancer Center)의 자금 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원뿔형 튜브(멸균)Midwest Scientific#C15B유사한 모든 것이 작동합니다
50 mL 원뿔형 튜브(멸균)Thermo Scientific339652유사한 모든 것이 작동합니다
Black/Clear 96 웰 플레이트Falcon353219Celligo에는 호환 가능한 플레이트 목록이 있습니다
. Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5C유사 항목
Celigo SoftwareNexcelcom Bioscience버전 5.3.0.0이와 유사한 모든 것이 작동합니다
세포 배양 인큐베이터Thermo ScientificHeraCell 160i이와 유사한 모든 것이 작동합니다
세포 배양 처리 플라스크 (T75, 다양한 크기, 멸균)TPP90076유사한 모든 것이 작동합니다
CFSETonbo13-0850-U500유사한 모든 것이 작동합니다
Cytek Muse 세포 분석기Cytek0500-3115유사한 모든 작동
DMEMGibco11995-040모든 유사한 작동
FBSGemini 바이오 제품900-108모든 유사한 작동
세포 분석기Cytek, BD 등Aurora, LSR II 등유사한
FlowJo SortwareBecton Dickinson & 회사 버전 10.7.1이와 유사한
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01모든 유사한 것이 작동합니다
GraphPad 소프트웨어GraphPad버전 9.3.1 (471)유사한 모든 것이 작동합니다
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2모든 유사한 것이 작동합니다
PBSGibco10010-031유사한 것이 작동합니다
PenStrepGibco15070-063이와 유사한 모든 것이 작동합니다
. 피펫 팁 (멸균, 필터링, 1 mL, 다양한 크기)Pr1maPR-1250RK-FL 등유사한 것이 모두 작동합니다
. 피펫터 Thermo ScientificFinnpipette F2모든 유사한 작동
Propidium IodideInvitrogenP1304MP유사한 모든 작동
RPMICorning10-041-cv모든 유사한 작동
청 학적 피펫 보조Drummond Scientific4-000-105모든 유사한 작동
청 피펫 (멸균, 다양한 크기)Pr1maPR-SERO-25, 등모든 유사한 것이 작동합니다
나트륨 피루브산코닝25-000-CI모든 유사한 것은 작동
할 것입니다 멸균 저장소Midwest ScientificRESE-2000모든 유사한 작동
탑 원심 분리기Eppendorf5810R유사한 모든 것이 작동합니다
흐름 모든 작동 모든 것이 작동합니다 모든 혈 혈 테이블

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....

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