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방법 논문

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

2.2K 조회수

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DOI:

10.3791/65589

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2024년 1월 12일

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

이 논문에서

요약

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

초록

히스톤 단백질은 진핵생물 사이에서 매우 풍부하고 보존되어 있으며 번역 후 변형(PTM)으로 알려진 구조의 결과로 유전자 조절에 큰 역할을 합니다. 외부 또는 유전적 요인과 관련하여 각 PTM의 위치 및 특성 또는 PTM 패턴을 식별하면 이 정보를 DNA 전사, 복제 또는 복구와 같은 생물학적 반응과 통계적으로 연관시킬 수 있습니다. 본 연구에서는 생물학적 샘플에서 히스톤 PTM을 검출하기 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동성 분광법 및 ToF(Time-of-Flight) 질량분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 사용하면 단일 분석에서 생물학적으로 가장 관련성이 높은 변형을 분리하고 PTM을 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 이동성 트랩에서 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용하는 종속 데이터 수집(DDA)의 최근 개발을 활용합니다. Histone PTM은 머무름 시간, 이동성 및 단편화 패턴에 따라 자신 있게 할당됩니다.

서론

진핵 세포에서 DNA는 뉴클레오솜(nucleosome)이라고 하는 기능적 단위로 염색질로 포장됩니다. 이 단위는 4 개의 코어 히스톤 (H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2 개) 1,2,3,4의 옥타머로 구성됩니다. 히스톤은 진핵생물에서 가장 풍부하고 고도로 보존된 단백질 중 하나로, 유전자 조절에 크게 관여한다5. 히스톤 번역후 변형(PTM)은 염색질 역학의 조절에 큰 역할을 하며 DNA 전사, 복제 및 복구와 같은 다양한 생물학적 과정을 조작한다6. PTM은 주로 DNA 3,7과 접촉하는 히스톤의 N- 말단 영역의 접근 가능한 표면에서 발생합니다. 그러나 꼬리와 코어 변형은 염색질 구조에 영향을 미쳐 뉴클레오솜 간 상호 작용을 변경하고 특정 단백질을 모집합니다 3,8.

액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 기반 단백질체학의 현재 과제는 관심 분석물질의 잠재적인 동시 용리입니다. 데이터 의존적 분석(DDA)의 경우, 이는 MS/MS 수집 공정 중 여러 전구체 이온의 잠재적 손실로 해석됩니다9. ToF(Time-of-Flight) 기기는 매우 높은 주파수 9,10(최대 수십 kHz)11에서 스펙트럼을 획득합니다. 따라서 복잡한 시료(MS1) 내의 전체 전구체 이온을 빠르게 스캔할 수 있으므로 최적의 감도와 MS/MS 염기서열분석 속도(최대 100Hz)9를 약속하고 생물학적 시료 분석에 이상적입니다10. 그럼에도 불구하고 이러한 높은 스캔 속도에서 사용할 수 있는 감도는 MS/MS 속도9에 의해 제한됩니다. 이러한 한계를 완화하기 위해 직교 사중극자 비행 시간(qToF) 질량 분석기와 함께 TIMS(Trapped Ion Mobility Spectrometry)를 추가했습니다. TIMS에서 모든 전구체 이온은 사중극자9로 단일 전구체 질량을 선택하는 대신 이동성의 함수로 나란히 축적되고 용리됩니다. PASEF(Parallel Accumulation-Serial Fragmentation)는 감도 손실 없이 초당 수백 개의 MS/MS 이벤트를 허용합니다9.

이 연구의 주요 목표는 이동성 트랩의 병렬 축적에 이어 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리(CID)를 사용하여 DDA의 최근 발전을 보여주는 것이었습니다. Histone PTM은 머무름 시간(RT), 이동성 및 단편화 패턴을 기반으로 자신 있게 할당되었습니다.

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프로토콜

참고: 히스톤 샘플은 Bhanu et al. (2020)12에서 채택된 방법을 사용하여 추출되었습니다.

1. 샘플 준비

  1. 배양된 세포 채취
    1. 세포가 80% 합류하면 트리판 블루 배제를 사용하여 세포가 생존 가능한지 확인합니다.
      참고: 이 실험에는 HeLa S3 세포주가 사용되었지만, 이 방법은 모든 배양 세포에 적용할 수 있습니다.
    2. 배지를 흡인한 다음 각 플레이트에 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 적용합니다.
    3. 플레이트를 소용돌이쳐 잔류 배지를 모두 헹군 다음 PBS를 흡입하고 5mL의 1x PBS를 적용합니다.
    4. 일회용 셀 리프터로 세포를 긁어 플레이트에서 세포를 부드럽게 분리합니다.
    5. 각 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
    6. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.
    7. 세포 펠릿에서 PBS를 흡입합니다.
    8. 히스톤 추출을 진행합니다.
      알림: 즉시 처리할 수 없는 경우 세포 펠릿을 액체 질소에 급속 동결하십시오. 진행할 준비가 될 때까지 펠릿을 -80°C에서 보관하십시오.
  2. 히스톤 추출
    1. 각 세포 펠릿의 부피를 추정하고 반월상 연골을 영구 마커로 표시합니다.
    2. 모든 샘플에 대해 충분한 핵 분리 완충액 (NIB, 15mM Tris-HCl (pH 7.5), 15mM NaCl, 60mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM CaCl2 및 250mM 자당)을 준비하십시오. 또는 시간이 지남에 따라 많은 샘플을 처리해야 하는 경우 버퍼를 대량으로 만들어 2-8°C에서 최대 6개월 동안 보관하거나 각 추출에 필요한 양만 해동하여 -15°C에서 -25°C에서 무기한 분획 및 동결합니다.
      참고: 버퍼는 보관하는 동안 깨끗한 상태로 유지되어야 합니다. 버퍼가 흐리거나 비정상적인 모양을 취하면 언제든지 버퍼를 버리고 새 버퍼를 준비하십시오.
    3. 세척 완충액의 세포 펠릿 부피의 50배를 준비하고, 다음과 같이 억제제를 첨가한다(시료 2개당 세척 완충액 약 10mL).
      1. 세척 완충액 10mL를 제조하기 위해 10mL의 NIB, 30μL의 200mM 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드[AEBSF], 10μL의 1M 디티오트레이톨[DTT], 20μL의 5μM 마이크로시스틴, 20μL의 5M 부티레이트나트륨을 혼합합니다.
    4. 세척 완충액의 1/5을 제거하여 용해 완충액을 준비합니다(세척 완충액의 1/5 부피, 0.3% NP-40 또는 NP-40 대체물).
      참고: NP-40 또는 NP-40 대안 대신 Triton-X 100을 사용하지 마십시오.
    5. 세포 펠릿을 세척 완충액 5컬럼에 현탁시키고 4°C에서 5분 동안 800 x g 에서 원심분리하여 완전히 세척합니다. 이 단계를 두 번 완료하여 세척 사이에 상층액을 흡입하고 버립니다.
    6. 세포 펠릿의 부피가 여전히 영구 마커로 표시되어 있는지 확인하십시오. 10 볼륨의 용해 완충액에 재현탁합니다.
    7. 각 펠릿을 피펫으로 완전히 혼합하여 재현탁한 다음 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
    8. 15분 후 4°C에서 5분 동안 800 x g 에서 원심분리합니다.
    9. 상층액을 흡입하고 폐기하십시오.
      알림: 펠릿은 원래 펠릿 크기의 ≤ 1/2 로 줄여야 합니다(마커 라인으로 표시됨). 펠릿이 충분히 감소하지 않은 경우 용해 절차를 반복하고 유봉을 사용하여 세포를 부수는 부드러운 균질화 단계를 포함합니다.
    10. 용해가 완료되면 펠릿을 500μL의 세척 완충액에 재현탁시킨 다음 800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하여 버린 다음 세척 단계를 한 번 더 반복하여 NP-40의 모든 흔적을 제거합니다.
      알림: 이 시점에서 펠릿은 히스톤을 포함하는 염색질로 구성됩니다.
    11. 펠릿을 0.4 N H2SO4의 5 부피 (원래 세포 펠릿 크기)로 재현탁시킵니다.
    12. 교반기를 사용하여 추운 방이나 냉장고에서 2시간 동안 배양합니다.
    13. 2시간 후 샘플을 3400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리지 마십시오.
    14. 상층액을 새 튜브로 옮기고 100% 트리클로로아세트산(TCA)을 내용물 부피의 1/3로 급증시킵니다(최종 TCA 농도는 약 20%).
    15. 튜브를 부드럽게 뒤집고 투명하고 무색의 용액이 흰색 및/또는 탁하게 변하여 단백질 침전을 나타내는 것을 관찰합니다.
      참고 : 히스톤 농도가 낮은 용액의 경우 단백질 침전이 즉시 눈에 띄지 않을 수 있지만 침전물은 하룻밤 배양 후에 볼 수 있어야합니다.
    16. 히스톤 단백질을 완전히 침전시키기 위해 4 ° C에서 밤새 (12-18 시간) 방해없이 배양하십시오.
    17. 다음 날, 4 °C에서 5 분 동안 3400 x g 으로 원심 분리합니다.
    18. 피펫 팁이 있는 튜브의 측면을 만지지 않도록 주의하면서 상층액을 흡입합니다. 이 단계에서 히스톤은 주로 튜브의 측면 주위에 필름으로 증착됩니다.
    19. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 튜브에 500μL의 얼음처럼 차가운 아세톤 + 0.1% HCl(산성 아세톤)을 추가한 다음 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집습니다. 배열amp이 작업을 수행하는 동안 샘플을 순서대로(1, 2, 3 등) 잘못된 아세톤이 튜브의 표시를 제거할 수 있습니다. 3400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 부드럽게 디캔팅합니다.
    20. 500μL의 얼음처럼 차가운 100% 아세톤과 유리 파스퇴르 피펫으로 이 헹굼 단계를 반복합니다. 3400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 부드럽게 디캔팅합니다.
    21. 남은 아세톤이 증발할 때까지 튜브를 열어 실온에서 건조시킵니다.
    22. 건조되면 각 튜브에 100μL의 질량분석법(MS) 등급의 물을 추가합니다. 이 물방울을 사용하여 용기의 모든면을 면봉으로 닦아 전체 히스톤 필름을 재현 탁시킵니다. 액적을 튜브 측면에 피펫팅하고 위아래로 피펫팅하면서 회전시키거나 100μL의 절반을 분주하고 팁을 사용하여 전체를 저어줍니다. 두 가지 방법을 조합하는 것이 가장 좋습니다. 히스톤은 물에 쉽게 용해되며 용액에 있을 것입니다.
    23. 모든 샘플을 재현탁 한 후 흰색 고체가 남아있는 경우 실온의 욕조에서 5 분 동안 초음파 처리합니다.
    24. 800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 맑은 용액을 새 튜브로 옮깁니다. 남아 있는 불용성 펠릿은 폐기하십시오.
    25. 축소 조건에서 SDS-PAGE를 실행하여 추출이 깨끗한지 확인합니다.
      주: 젤은 10-20 kDa의 범위에 있는 단백질을 분화할 수 있는 한 polyacrylamide의 어떤 적합한 농도든지를 사용하여 달릴 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 겔에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
    26. 단백질 농도 분석(예: Bradford 또는 BCA)을 수행하여 총 단백질 농도를 측정합니다.
  3. 라이신 잔기의 화학적 유도체화(프로피오닐화)
    1. 20μg의 히스톤(단백질 분석에 의해 결정됨)을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 진공 농축기를 사용하여 이 샘플을 <5μL로 건조시킨 다음 20mL 100mM 중탄산 암모늄(NH4CO3)(~1μg/μL 용액)을 사용하여 재현탁합니다. 필요한 경우 수산화암모늄을 사용하여 pH를 ~8로 조정합니다.
      주의 : 수산화암모늄(NH4OH)을 사용하여 재현탁하지 말고 필요한 경우에만 pH를 조정하십시오. 그렇지 않으면 단백질이 변성되고 침전됩니다.
      알림: 최소한의 샘플 손실로 pH를 확인하려면 피펫 팁을 사용하여 샘플에 담그고 pH 스트립에 두드려 줍니다. 이 테스트 절차는 나머지 샘플 준비 단계에서 유용합니다.
    2. 프로피온산 무수물을 아세토니트릴(ACN)에 1:3(v/v) 비율로 첨가하여 프로피오닐화 시약을 준비합니다(즉, 40μL의 시약을 만들기 위해 10μL의 프로피온산 무수물과 30μL의 ACN을 결합).
      참고: 전통적으로 메탄올 또는 이소프로판올은 프로피오닐화 시약의 제조에 사용되었습니다. 프로피오닐화는 아미드 형성 반응이기 때문에 메탄올 사용으로 인해 발생하는 메틸 프로피오닐 에스테르와 같은 원치 않는 부산물 및 반응을 방지하기 위해 아세토니트릴과 같은 비양성자 용매가 필요합니다. 시약이 신선하게 유지되도록 한 번에 최대 4개의 샘플에 충분한 프로피오닐화 시약만 준비하십시오. 준비 후 1-2분 이내에 시약을 사용하십시오. 시약이 앉으면 프로피온산 무수물이 주변 수분과 반응하고 아세트산이 형성되기 시작하여 시약의 효과를 변경할 수 있으며 시약이 첨가되면 히스톤 용액의 pH가 변경됩니다.
    3. 프로피오닐화 시약을 1:4(v/v)로 각 샘플에 추가합니다(즉, 히스톤 20μL의 경우 프로피오닐화 시약 5μL를 추가).
    4. 1 : 5 (v / v) NH4OH (즉, 히스톤 용액의 20 μL에 대해 4 μL 추가)를 빠르게 추가하여 용액의 pH를 ~ 8로 다시 설정합니다. pH가 여전히 너무 낮으면 pH 1이 될 때까지 NH4OH1-2μL를 한 번에 8μL씩 첨가합니다. 일반적으로 1:5(v/v) 비율이 적절합니다.
    5. 방해 없이 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
    6. 프로피오닐화 시약 배치당 3-4개 이하의 샘플에 대해 프로피오닐화 반응을 반복하여 산 형성을 최소화합니다.
    7. 프로피오닐화 절차 1.3.2-1.3.5단계를 반복합니다. 두 번째 프로피오닐화는 사용 가능한 라이신의 >95%가 유도체화되도록 합니다.
    8. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 <5μL까지 건조합니다. 이것은 NH4OH에서 방출되는 미반응 프로피오닐화 시약, 산성 생성물 및 암모니아 가스를 증발시킵니다. 샘플이 완전히 건조되면 심각한 샘플 손실이 발생하지 않으므로 괜찮습니다.
      알림: 병에 남아 있는 주변 수분과의 접촉으로 인한 아세트산 형성을 방지하기 위해 보관하기 전에 프로피온산 무수물 병의 공기를 아르곤 가스로 대체하십시오.
  4. 트립신을 이용한 단백질 분해 분해
    1. 히스톤을 100mM NH4HCO3 에 재현탁시켜 20 μL의 부피를 달성하여 1 μg / μL의 최적 농도를 달성합니다.
      참고: Sample 농도가 1μg/μL 미만인 용액은 트립신 효율을 감소시킵니다.
    2. 트립신을 히스톤 샘플에 1:10 비율(wt/wt)로 첨가합니다(즉, 2μL의 트립신 용액 1μL를 히스톤 20μg에 추가).
    3. 37°C에서 6-8시간 동안 반응을 배양합니다. 또는 실온에서 하룻밤(12-18시간) 배양합니다.
    4. -80°C에서 최소 1시간 동안 얼려서 소화를 중지합니다.
      알림: 소화 반응을 소멸시키기 위해 산을 사용하면 절차의 이 시점에서 원치 않는 pH 강하가 발생할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 시료는 진행할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다(중간 정지 지점).
  5. 펩타이드 N-말단의 화학적 유도체화(프로피오닐화)
    1. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 <5μL로 건조합니다.
    2. 100 mM NH4HCO3를 사용하여 샘플을 최대 20 μL(1 μg/μL)까지 재현탁시킵니다.
    3. 이전과 같이 프로피오닐화를 반복합니다(1.3단계).
      참고: 수성: 유기 상비가 높기 때문에 이 단계에서 샘플을 건조하는 데 시간이 더 오래 걸리는 것은 정상입니다.
  6. 스테이지 팁을 사용한 시료 탈염
    1. 50μL의 MS 등급 물 + 0.1% TFA로 샘플을 재현탁하거나 희석합니다.
    2. 11-G 샘플 코어를 사용하여 고체상 추출 디스크에서 C18 물질의 디스크 5개를 펀칭합니다(피펫 팁으로 옮기기 전에 5개의 디스크를 모두 펀칭). 디스크를 삽입하고 200μL 피펫 팁의 바닥에 안전하고 균일하게 끼워졌는지 확인합니다(그림 1).
      참고: 단일 스테이지 팁을 통해 25μg 이상의 시료를 탈염하는 경우 15G 코어를 사용하십시오.
    3. 원심분리기 어댑터를 사용하여 스테이지 팁을 1.5mL 또는 2mL 미세 원심분리기 튜브에 고정합니다.
      알림: 다음 원심분리 단계의 경우 400°C에서 한 번에 500-4분 동안 저속(1-2 x g) 회전을 사용하십시오. 용매는 일반적으로 C18 재료가 팁에 얼마나 단단히 채워져 있는지에 따라 1분 이내에 수지를 통과합니다.
    4. 50μL의 100% 아세토니트릴로 원심분리하여 수지를 헹구어 C18 재료를 활성화하고 잠재적인 오염 물질을 제거합니다.
      알림: 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 s에 용액을 로드하는 것이 더 쉬울 수 있습니다.tage-팁. C18 재료가 활성화되면 탈염 절차 동안 수지가 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다.
    5. 원심분리를 통해 디스크 재료를 80μL의 MS 등급 물 + 0.1% TFA로 평형화합니다.
    6. 빙초산을 사용하여 샘플을 pH 4 이하로 산성화합니다. 샘플 손실을 최소화하기 위해 이전과 같이 pH 스트립으로 pH를 확인하십시오.
    7. 느린 원심분리를 통해 시료 전체를 수지 디스크에 로드합니다.
    8. 원심분리를 통해 80μL의 MS 등급 물 + 0.1% TFA로 샘플을 세척합니다.
    9. 느린 원심분리를 통해 75% 아세토니트릴 70μL와 0.5% 아세트산을 플러싱하여 샘플을 깨끗한 1.5mL 튜브에 용출합니다. 전체 시료 부피가 스테이지 팁에서 용리되도록 하기 위해 추가 원심분리 시간을 사용할 수 있습니다. 추가 원심분리 시간에 수지가 건조되어도 시료 용출 후에는 더 이상 필요하지 않으므로 괜찮습니다.
    10. 진공 농축기에서 각 샘플을 완전히 건조시킵니다.
      알림: sample(s)는 진행할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다(중간 중지 지점).
    11. LC-MS/MS 분석의 경우 최종 농도가 0.4μg/μL인 액체 크로마토그래피(LC) 프로토콜에서 용매 A(0.1% 포름산) 부피로 샘플을 재구성합니다(즉, 20μg의 히스톤을 용해하여 용매 A 50μL).

2. TIMS 소프트웨어 인터페이스

  1. Instrument( 계측기 ) 탭을 선택하고 Operate(작동 )로 전환합니다(계측기 이름이 녹색으로 강조 표시되는지 확인)(그림 2).
  2. TIMS 매개변수를 확인합니다(그림 2).
  3. MS 설정(스캔 시작, 스캔 종료, 이온 극성, 스캔 모드)을 확인합니다(그림 2).
  4. TIMS 설정(모드, 이동성 시작, 이동성 종료, 램프 시간, 누적 시간, 듀티 사이클, 램프 속도, MS 속도, MS 평균화 및 자동 보정)을 확인합니다(그림 2).
  5. Source 탭으로 이동하여 TuneMix 보정 단계(그림 3)13에 대해서만 주사기 옵션(Hamilton 500μL)을 활성화합니다.
  6. 캘리브레이션 탭으로 이동하여 m/z를 클릭하고 캘리브레이션 모드를 선택하고 모드(일반적으로 Enhanced Q), 확대/축소(+0.01%) STD Dev(0.24)를 선택하고 캘리브레이션을 클릭합니다. 점수가 100%에 도달하면 수락합니다(그림 4).
  7. 이동성 탭으로 이동하여 보정 프로세스(일반적으로 선형 모드), 감지 범위(+5%), 너비(0.1Da), STD 장치(0.1855)를 반복한 다음 보정을 클릭합니다. 98.5%≥ 점수가 나오면 수락합니다(그림 5).
  8. 메서드로 이동하여 사용할 메서드를 선택하십시오. 이 예에서는 Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl 이 선택되었습니다(그림 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS (영어)

  1. 4500V 모세관 전압, 800V 엔드플레이트 오프셋, 3.0bar 분무기 압력, 10.0L/min 건조 가스, 200°C 건조 히터 및 50μL/min 주입 유량과 같은 일반적인 nESI 작동 조건을 사용하십시오.
  2. 6eV 충돌 에너지, 1200Vpp 충돌 RF, 75μs 전송 시간, 5μs 프리펄스 저장과 같은 일반적인 MS 설정을 사용합니다.
  3. 입구 깔때기(P1)와 출구 깔때기(P2)의 압력차를 이용하여 드리프트 가스 유량을 결정합니다. 병렬 축적-직렬 단편화(PASEF)는 TIMS 셀에서 발생하여 모든 전구체 이온을 개별적으로 축적하지 않고 동시에 축적합니다. 그런 다음 전구체 이온은 일반적으로 훨씬 더 넓은 피크(약 50배 더 짧음)에 비해 좁은 이온 피크에서 방출되어 신호 대 잡음비를 증가시키면서 이동성14를 통해 동시 용리 펩타이드를 분리합니다.
  4. 단백질 분해 히스톤 펩타이드 분석을 위한 LC-TIMS-ToF MS/MS 분석법을 개발합니다. C18 (300Å, 5μm, 4.6mm x 250mm) 컬럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 독점적인 PASEF 기술이 적용된 상용 TIMS-TOF MS 기기와 결합합니다.
    참고: 이 컬럼 크기는 이전에 발표된 연구15,16,17을 기반으로 펩타이드 혼합물에 대해 높은 pH와 낮은 pH 모두에서 우수한 분리를 제공하는 것으로 확인되었습니다.
    1. 주입량을 시료 20μL(8μg)로 설정하고 유속을 0.4mL/분으로 설정합니다.
    2. 0.1% 포름산(용매 A)이 포함된 물과 0.1% 포름산(용매 B)이 포함된 아세토니트릴을 사용하여 60분 동안 비선형 LC 그래디언트를 실행합니다. 그라디언트를 설정합니다: 2.7분 동안 10% B, 5.3분 후에 20% B, 4분 후 28% B, 18분 후 35% B, 13분 후 40% B, 2분 후 100% B로 설정합니다. 100% B를 5분 동안 유지한 후 10분 동안 농도를 5% B로 낮추고 마지막 5분 동안 유지합니다.
  5. 양이온화 모드에서 나노 전기분무 이온화(nESI)를 통해 HPLC에서 TIMS-TOF로의 시료 용리를 검증합니다.

4. 데이터 분석

  1. 펩타이드 염기서열과 변형 부위를 식별합니다.
    1. MS-digest 도구에서 ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest]를 사용하여 이론적인 펩타이드 목록을 준비합니다.
      1. 분해물의 조건(사용된 효소), 검색 중인 PTM의 유형(예: 모노, 디 또는 트리메틸화), 검색 중인 펩타이드의 크기 범위, 질량 검출 범위 및 잠재적인 절단 누락 수를 고려하면서 이론적 분해를 수행합니다.
  2. 이론적 펩타이드를 기반으로 수집된 데이터를 수동으로 분석합니다(그림 6)12.
    1. 각 이론적인 펩티드를 위한 몇몇 책임 국가 (+1에서 +4)에 질량을 위한 수색은 검색된다.
    2. 각 m/z 를 처음 식별한 후 피크를 선택하고 PTM을 포함한 펩타이드 서열을 기반으로 하는 단편화 이온의 이론적 목록을 사용하여 MS/MS를 확인합니다.
      참고: 확인된 펩타이드의 이동성이 이전에 알려진 경우 이것도 확인됩니다.
  3. 다양한 PTM의 상대적 존재도를 계산하고 각 변형을 지정된 펩타이드 서열의 백분율로 보고합니다.
    1. 감지된 각 PTM의 상대적 존재도는 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다.
      상대적 존재도 = PTM 면적/주어진 펩타이드에 대한 변형되지 않은 PTM 및 PTM의 총 면적

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결과

상향식 단백질체학 워크플로우(그림 7)에는 일반적으로 미처리 샘플에서 표적 단백질을 추출한 다음 단백질의 농도를 정량화한 다음 일반적으로 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피를 통한 분획이 포함됩니다. 분획 후, 단백질은 단백질 분해 효소(종종 트립신)를 사용하여 절단되고, 마지막으로 생성된 펩티드의 질량 분석 및 확립된 데이터베이스18을 사용하여 단백질 식별이 이루어집니다. 염기서열 정보는 표시된 질량 대 전하(m/z) 범위 내의 전구체 이온에서 파생되며, 이는 충돌 유도 해리(CID)를 거쳐 데이터베이스19 를 사용하여 식별 및 염기서열 분석될 단편화 패턴을 생성합니다(그림 8).

이 연구의 주요 목표는 프로토콜 섹션에서 앞서 설명한 단계에 따라 LC-TIMS-PASEF...

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토론

히스톤은 4개의 핵심 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2개)으로 구성된 옥타머 형태의 DNA와 상호 작용하여 염색질 구조를 조절하는 염기성 단백질입니다.20. 히스톤에는 수많은 라이신 및 아르기닌 잔기가 포함되어 있으며, 이는 쉽게 변형되어 히스톤 기능에 영향을 미치거나 다른 세포 단백질에 결합하여 염색질 화학을 변화시키는 광범위한 PTM을 유발합니다21. PTM은 여러 질병, 특히 여러 유형의 암에서 보고된 특정 PTM 그룹과 함께 작용하여 생물학적 반응을 유도할 수 있다22.

세포 수준에서 DNA 손상이 인식되면 병변이 표시된 복잡한 신호 전달 캐스케이드의 작용이 즉시 뒤따르며, 세포주기 진행의 조정과 필요한 복구 경로의 활성화가 뒤따릅니다. 또한, DNA 손상은 아세틸 및 메틸 부가물과 같은 다양한 변형을 유도하여 단백질 모집을 촉진한...

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공개 사항

멜빈 A. 파크(Melvin A. Park)와 매튜 윌렛츠(Matthew Willetts)는 timsTOF 악기 제조업체인 Bruker Daltonics Inc.의 직원입니다.

감사의 글

이 자료는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 보조금 번호(Grant No.) HRD-1547798 및 보조금 번호 HRD-2111661입니다. 이 NSF 보조금은 CREST(Centers of Research Excellence in Science and Technology) 프로그램의 일환으로 Florida International University에 수여되었습니다. 이것은 Florida International University의 탁월한 프로그램인 Institute of Environment의 기부 번호 1672입니다. 추가 지원은 미국 국립보건원(National Institute of Health)에서 보조금 번호로 제공되었습니다. 프란시스코 페르난데스-리마(Francisco Fernandez-Lima)와 그랜트 번호(Grant No.)R21AI135469 벤자민 A. 가르시아(Benjamin A. Garcia)와 국립과학재단(National Science Foundation)의 그랜트 번호(Grant No.)R01HD106051 CHE-2127882에서 Benjamin A. Garcia에게. 저자는 초기 분석법 개발 과정에서 Mario Gomez Hernandez박사의 초기 지원에 감사를 표하고자 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
-80 > C Freezer
1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL 피펫 팁Thermo Fisher Scientific94060710 Finntip Flex 1000 μ L, 비멸균, 비여과, 랙 팁
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific14-282-300최대 1.5 mL 10 µ의 시료를 간단하고 안전하게 처리하기 위해 이 튜브를 사용하십시오
. L 피펫 팁Thermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μ L, 비멸균, 비여과, 랙 10
% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps 세제 용액
10x Dulbecco' s PBS without Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL 원뿔형 튜브Corning352196Falcon 원추형 원심분리기 튜브
200 µ L 젤 로딩 피펫 팁Thermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand  젤 로딩 팁, 1– 200 &뮤; L
200 &마이크로; L 피펫 팁Thermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μ L, 비멸균, 비여과, 랙 팁
2x Laemmli 샘플 버퍼Bio-Rad1610737
50 mL 원추형 튜브Corning352070Falcon 원추형 원심분리기 튜브
96-웰 플랫 바닥 플레이트Thermo Fisher Scientific12565501
96-웰 플레이트, V-Bottom 600 μ LAxygenP-DW-500-C-S
아세톤시그마 Aldrich179124ACS 시약, ≥ 99.5%
세토니트릴(ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC,
0.1% 포름산(v/v)이 함유된 Fisher Chemical 아세토니트릴, LC/MS 등급Thermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS 등급, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF 염산염, 98%
탄산암모늄, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥ 99.5% (T)
수산화암모늄 용액, NH4OHSigma AldrichAX1303ACS 사양 충족, USP/NF 논문 테스트를 위한 시약 사양 충족 GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC 컬럼Waters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 & Aring;, 5 &마이크로; m, 4.6 mm X 250 mm, 1K– 15K
소 혈청 알부민(BSA)Sigma AldrichA7906열 충격 분율, pH 7, ≥ 98%
염화칼슘, CaCl2Sigma AldrichC4901무수, 분말, ≥ 97%
Cell dissociation bufferThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
일회용 세포 리프터Thermo Fisher Scientific  08100240Fisherbrand 세포 리프터; 일회용 리프터는 세포층을 빠르게 제거합니다
펠릿 페슬Thermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand  펠렛 유봉; 마이크로 원심분리기 튜브에서 단백질 및 DNA 펠릿을 재현탁하거나 연조직을 분쇄
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formic acid (FA)Sigma Aldrich695076ACS 시약, ≥ 96%
용융 실리카 모세관 75 μ m ID x 363 μ m OD(Molex (Polymicro)TSP075375
빙하 아세트산Thermo Fisher ScientificA38S아세트산, 빙하 (인증 ACS), Fisher Chemical
유리 파스퇴르 피펫Sigma AldrichBR747725-1000EA
고성능 액체 크로마토그래프  ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC 시스템
염산, HCl시그마 Aldrich258148ACS 시약, 37%
Hypercarb 30-40 μ m 탄소 150– 300 &어링;Thermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep 카트리지Thermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS 보정 표준, ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
염화마그네슘, MgCl2Sigma AldrichM8266무수, ≥ 98%
메탄올, HPLC용Thermo Fisher ScientificA454Optima, HPLC용, Fisher Chemical   
마이크로센트리퓨지 튜브 어댑터GL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences  Microcystin-LA
MS 시료 바이알, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL 부품LAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientific모델: ND3300
질소(N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH 지시 스트립, InstachekMicro Essential LabJR-113모델: Hydrion
Potassium chloride, KClSigma AldrichP3911ACS 시약, 99.0%– 100.5%
압력 주입 셀다음 발전  모델: PC77
Propionic AnhydrideSigma Aldrich8.00608합성용
냉장 원심분리기 (700– 18,000 x g)NuAire, 모델: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μ m, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE 겔Bio-Rad4569035Any kD 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), Mini-PROTEAN 전기영동 셀
부티르산나트륨Thermo Fisher ScientificA11079.0698+%
염화나트륨, NaClSigma AldrichS9888ACS 시약, ≥ 99.0%
SPE 디스크, C18VWR76333-134Empore SPE 디스크, C18, CDS 분석, 90 mm x 0.5 mm, 12 µ
m SpeedVac+ 진공 펌프 및 플레이트 로터Savant모델: SC210A
SucroseMillipore1.07651미생물학에 적합
황산, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF 질량 분석기Bruker Daltonics모델 Tims tof
ms 트리클로로아세트산 용액, TCASigma AldrichT06996.1  N
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma Aldrich302031HPLC에 적합합니다. 99.0%
Triversa NanomateAdvion모델: TR263
TrypsinProtease, MS 등급Thermo Fisher Scientific90057
튜브 회전기Thermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
0.1% 포름산(v/v), LC/MS 등급Thermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS 등급, Thermo Scientific 
SDS-PAGE 용 사전 혼합 단백질 샘플 버퍼 아중. 일회용 합니다

참고문헌

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