방법 논문

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

DOI:

10.3791/65605

⸱

2023년 7월 28일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

초록

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괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis, NEC)은 심각하고 치명적일 수 있는 장 질환으로, 복잡한 발병 기전으로 인해 연구가 어려웠으며, 아직 완전히 이해되지 않고 있습니다. NEC의 병태생리학에는 장 밀착 접합부의 파괴, 장 장벽 투과성 증가, 상피 세포 사멸, 미생물 미생물 미생물 불균형 및 조절 장애 염증이 포함됩니다. NEC를 연구하는 전통적인 도구에는 동물 모델, 세포주, 인간 또는 생쥐의 장 오가노이드가 포함됩니다. 이러한 모델 시스템을 사용한 연구는 질병 병태생리학에 대한 현장의 이해를 향상시켰지만, 인간 NEC의 복잡성을 요약하는 능력은 제한적입니다. NEC-on-a-chip이라고 하는 미세유체 기술을 사용하여 NEC의 개선된 시험관 모델이 현재 개발되었습니다. NEC-on-a-chip 모델은 인간 내피 세포 및 중증 NEC를 앓고 있는 유아의 마이크로바이옴과 함께 배양된 조산아에서 유래한 장내 장내형 장내형 물질로 파종된 미세유체 장치로 구성됩니다. 이 모델은 NEC의 병태생리학에 대한 기계론적 연구를 위한 귀중한 도구이자 신생아 장 질환에 대한 약물 발견 테스트를 위한 새로운 리소스입니다. 이 원고에서는 NEC-on-a-chip 모델에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.

서론

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괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis, NEC)은 조산아에게 영향을 미치며, 체중 1500g < 출생아의 경우 발병률이 최대 10%에 이른다1. NEC의 병태생리학은 복잡하며 장 상피의 손상, 장 밀착 접합부의 파괴, 장 장벽 투과성 증가, 면역 조절 장애 및 상피 세포 사멸을 포함합니다 2,3. NEC의 발병기전과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 이해는 불완전하며, 수십 년간의 연구에도 불구하고 효과적인 표적 치료법은 아직 없습니다.

NEC 연구의 진전을 가로막는 중요한 장벽은 인간 유아로부터 분리한 1차 장 조직의 가용성이 제한적이고 크기가 작다는 것입니다. NEC를 앓고 있는 영아의 장 조직을 절제하면 괴사하고 심하게 손상되는 경우가 많아 질병 발병 전 메커니즘에 대한 연구가 복잡해집니다. 예를 들어, NEC를 앓고 있는 영아의 소장에는 면역 세포가 넘쳐나며, 장 줄기세포의 수가 감소하고, 상피 세포 증식이 감소하며, 상피 세포 사멸이 증가한다 4,5,6,7.....

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프로토콜

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엔테로이드는 NEC 또는 비염증성 병인이 있는 기타 장 질환에 대한 수술 시 얻은 미숙아(임신 22주에서 36주에 출생)의 소장 샘플에서 유래되었습니다. 모든 검체 채취 및 처리는 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교(IRB 프로토콜 번호 201706182 및 201804040)와 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교(IRB 프로토콜 번호 21-3134)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Boards)의 정보에 입각한 동의 및 승인을 받은 후 수행되었습니다.

1. 장내형 질환을 확립하기 위해 인간 신생아 소장에서 크립트의 분리 및 도금

  1. 배지 준비
    1. 표 1에 설명된 대로 필요한 모든 매체를 준비합니다. 모든 매체 준비에 무균 기술이 사용되는지 확인하십시오. 필터: 0.2μm 필터를 사용하여 배지를 멸균하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
  2. 장 조직 세척 및 다지기
    1. 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 얼음 위에 올려 해동합니다. 수술실에서 인간의 장 조직을 얻습니다. 즉시 샘플을 5mL의 얼음처럼 차가운 조직 세척 배지에 넣어 내인성 프로테아제를 비활성화합니다.
    2. 트리밍된....

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결과

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엔테로이드를 미세유체 장치(그림 1)에 파종하고 상술한 바와 같이 배양하였다. 파종 전 세포 배양 매트릭스 하이드로겔에서 엔테로이드의 성장과 파종 후 장 상피 세포 단층의 후속 확장은 명시야 현미경을 통해 모니터링되었습니다(그림 2). 합류하는 장 상피 세포 단층이 형성된 후 성숙한 3D 융모와 같은 구조로 발전했습니다(그림 2). 장내 유래 신생아 장 상피와 HIMECs가 파종된 이 미세유체 장치는 신생아 장-온-어-칩 모델(36)로 알려져 있습니다.

NEC-on-a-chip 모델은 신생아 NEC 중에 존재하는 미생물 미생물 불균형을 재현하기 위해 개발되었습니다. 이 모델에는 중증 NEC가 있는 신생아의 dysbiotic 마이크로바이옴을 신생아 intestine-on-a-chi.......

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토론

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이 NEC-on-a-chip 시스템은 NEC의 병태생리학을 모델링하는 데 사용할 수 있는 강력한 새 도구입니다. 이 플랫폼은 연속적인 발광 흐름 및 스트레치가 있는 공동 배양 시스템을 통합하여 이전 모델보다 생체 내 장 내 환경과 더 유사한 복잡한 미세환경을 제공합니다. 이러한 조건은 성숙한 상피 하위 유형과 단단한 접합부로 구성된 고도로 편광된 상피가 늘어선 3D 융모와 같은 구조의 발달을 촉진합니다(그림 2)36. 또한 정점 상피 표면은 환자 유래 미생물 또는 새로운 치료제와 같은 실험 자극에 노출되기 위해 쉽게 접근할 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 관련 환자 집단에서 파생된 장내유세포를 활용하여 다양한 염증성 및 비염증성 장 질환과 정상적인 장 상피 발달 메커니즘을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 모델을 사용하면 단일 환자 샘플에서 데이터 수집을 극대화할 수 있으며, 이는 신생아 장 샘플의 제한된.......

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공개 사항

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저자는 이 원고와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 원고는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 R01DK118568(MG), R01DK124614(MG) 및 R01HD105301(MG), Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749(MG), Thrasher Research Fund Early Career Award(LCF), UNC Children's Development Early Career Investigator Grant(LCF)의 지원을 받았습니다. 채플 힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교의 소아과.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
[Leu15]-Gastrin I humanSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 멀티모드 마이크로플레이트 리더Agilent  7131000
브랜드 메타크릴레이트(PMMA) 큐벳, 세미 마이크로BrandTech759085D
세포 회수 솔루션Corning354270
CFX Opus Real-Time PCR 시스템Bio-Rad12011319
칩 크래들에뮬레이트N/A
Chip-S1 Stretchable 칩에뮬레이트N/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Clear TC 처리된 다중 웰 플레이트,  48 웰 Corning3548
콜라겐Sigma-AldrichC5533
콜라겐분해효소, 타입 I, 분말Gibco17018029
완전한 인간 내피 세포 매체 키트 Cell BiologicsH-1168
원뿔형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 15 mLFisher Scientific05-539-12
원뿔형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 50mLFisher Scientific05-539-8
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드Invitrogen C10283
Countess II 자동 세포 계수기Invitrogen 
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, 음이온성, 라이신 고정 가능한Invitrogen  D7132투과성 염료 
디메틸 설폭시드 (DMSO)시그마-알드리치D8418
일회용 PES 필터 유닛, 0.2um aPES 멤브레인피셔 사이언티픽FB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
당나귀 혈청시그마-알드리치D9663
둘베코&프라임; s 수정된 독수리&프라임; s 매체 - 고포도당Sigma-AldrichD5796
Dulbecco′ s 인산염 완충 식염수 (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0Corning46-034-CI
ER-1 표면 활성화 시약ER-1Chip 활성화 시약 1
ER-2 표면 활성화 시약을ER-2칩 활성화 시약 233016015
nbsp; 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시, 100mmFisher ScientificFB0875713
젤라틴 기반 코팅 솔루션 Cell Biologics6950
지니 템프 셰이커 300Scientific Industries, Inc.)SI-G300
겐타마이신 Gibco15750060
HEPES, 액체 1M 용액 (238.3 mg/ mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate InvitrogenH3570
인간 콜라겐 유형 ISigma-AldrichCC050
인간 1차 소장 미세혈관 내피 세포세포 생물학적 제제H-6054
도립 현미경Fisher Scientific03-000-013
Isotemp 범용 디럭스 수조Fisher ScientificFSGPD10
L-글루타민 Gibco25030-081
Luria Broth (LB) 한천, MillerSupelcoL3027
L-WRN 셀 American Type Culture CollectionCRL-3276
Matrigel 성장 인자 감소 기저막 매트릭스, LDEV-free Corning356231세포 배양 매트릭스
N-2 보충제 (100x)Gibco17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma-Aldrich1009005
NAILSTAR UV LAMPNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC  마이크로볼륨 UV-Vis 분광 광도계Thermo Scientific840-274200
니코틴아미드시그마-알드리치72340
Orb-HM1 허브 모듈에뮬레이트N/A
파라포름알데히드ThermoFisher047392.9L
페니실린-스트렙토마이신 Gibco15140122
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805
피펫 팁 TR LTS 1000µ L S 768A/8Rainin17014966
Pod 휴대용 모듈에뮬레이트N/A
프리미엄 등급 태아 소 세럼 (FBS)(열 비활성화) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect 역전사 키트 QIAGEN205313
재조합 쥐 표피 성장 인자 (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
스퀘어 바이오 어세이 접시, 손잡이가 있음, TC 처리되지 않음 코닝431111
SsoAdvanced Universal SYBR  그린 슈퍼믹스Bio-Rad1725271
Steriflip-GV 멸균 원심분리기 튜브 상단 필터 유닛MilliporeSE1M179M6
멸균 세포 여과기, 70umFisher Scientific22-363-548
멸균 주사기, 10mLFisher Scientific14-955-453
직선, 세밀, 날카로운 가위Miltex  InstrumentsMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD 원심분리기Thermo Scientific75016052
Triton  엑스-100 Sigma-AldrichT8787세제
TRIzol 시약 Invitrogen15596026RNA 추출 시약
Trypan Blue Solution, PBS에서 0.4% (w/v), pH 7.5 ± 0.5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드 없음 Gibco12604013효소 해리 시약
트립신-EDTA 용액Sigma-AldrichT4174
VIOS 160i CO2 인큐베이터, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 배양 모듈에뮬레이트N/A
인간 태반에서 추출한 AMQAX1000 에뮬레이트;피브로넥틴 인간 단백질, 플라즈마 Gibco Fisherbrand를 에뮬레이트& Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. (세포 생물학 제제 6950

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344(2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3),....

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