필라멘트 시아노박테리아의 타임랩스 현미경 분석을 위한 수직 고정화 방법

Summary

우리는 XY 평면에서 필라멘트 시아노박테리아 시각화를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제시합니다. 저융점 아가로스 매트릭스가 사용되어 수직 방향에서 분열에 관여하는 단백질의 이미지를 획득할 수 있었습니다. 따라서 이 방법론은 모든 필라멘트 유기체와 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있습니다.

Abstract

박테리아 세포 분열의 주요 사건은 단백질 FtsZ가 핵심 요소인 중격 과정입니다. FtsZ는 중합되어 세포의 중간에 고리형 구조(Z-ring)를 형성하여 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 한다. 박테리아 모델 대장균(Escherichia coli) 과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis )의 초고해상도 현미경은 Z-링이 불연속적이라는 것을 보여주었고, 라이브 셀 이미징 연구는 FtsZ가 트레드밀링으로 알려진 메커니즘에 의해 링을 따라 움직이는 것으로 나타났습니다. 생체 내에서 FtsZ의 역학을 연구하기 위해서는 XY 평면에서 링의 전체 구조를 이미징하기 위해 수직 위치에 특수 셀 배치가 필요합니다. Anabaena sp. PCC7120와 같은 다세포 시아노박테리아에서 FtsZ 이미징의 경우 세포의 크기와 필라멘트의 길이 때문에 필라멘트를 수직 위치로 유지하는 것이 어렵습니다. 이 기사에서는 Anabaena sp. PCC 7120 필라멘트는 저융점 아가로스와 주사기를 사용하여 FtsZ-sfGFP 융합 단백질을 발현하는 돌연변이에서 Z-링을 기록합니다. 이 방법은 컨포칼 현미경을 사용하여 분열 부위에서 단백질 역학을 빠르고 저렴하게 기록할 수 있는 방법입니다.

Introduction

박테리아 세포 분열은 모세포가 두 개의 딸 세포를 생성하는 과정으로, 대부분의 경우 이분법으로 알려진 메커니즘에 의해 생성됩니다. 중격 과정에서 가장 초기의 사건 중 하나는 셀¹의 중간에 FtsZ의 국소화입니다. 튜불린²와 구조적으로 상동성인 이 단백질은 보존되어 대부분의 박테리아에 널리 분포되어 있으며, 중합은 Z-링³으로 알려진 수축 구조를 생성합니다. 이 고리는 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 하며 함께 점쟁이라고 하는 분자 기계를 형성합니다. 여러 연구에 따르면 Z-링은 매우 역동적이며 FtsZ 프로토필라멘트는 트레드밀링 ^4,5,6에 의해 움직입니다. 타임랩스 실험에서 Z-링을 연구하려면 더 나은 해상도와 빠른 샘플링을 위해 XY 평면에 분할 부위를 기록하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기 위해서는 일반적으로 마이크로홀 세포 트랩 및 복잡한 미세유체 장치의 나노 제조를 포함하는 수직 세포 고정화 방법을 개발할 필요가 있습니다(⁷).

시아노박테리아는 세포 형태에 따라 그람 음성으로 분류되는 광합성 미생물입니다. 그러나 계통발생학적으로 그들은 그람 양성균에 더 가깝다⁸. 이 유기체는 그람 양성균과 그람 음성균 내에서 흔히 볼 수 있는 세포 분열 유전자를 가지고 있지만, 그 점에는 독특한 원소도 포함되어 있다⁹. Anabaena sp. PCC 7120(이하 Anabaena sp.)은 하나의 분열면을 가진 필라멘트 시아노박테리아로 다세포 시아노박테리아의 세포 분열 연구를 위한 모델입니다. 이러한 변형에서, 셀⁽¹⁰)의 중간에서 FtsZ의 위치를 결정하는 것이 가능하였다. 그럼에도 불구하고 이 모델에서 FtsZ의 생체 내 역학을 보여주는 연구는 없습니다. 우리 실험실에서는 삼부모 짝짓기와 상동 재조합을 통해 완전히 분리된 Anabaena sp. 완전한 내인성 ftsZ 유전자를 대체한 sfGFP에 융합된 FtsZ 단백질을 발현합니다. 우리는 필라멘트 시아노박테리아의 분열 단백질을 시각화하기 위한 타임랩스 실험을 위해 돌연변이 균주 필라멘트의 수직 방향을 선호하는 빠르고 간단한 세포 고정화 방법을 개발했습니다. 이 방법은 비싸고 개발하기 어려울 수 있는 미세유체 장치가 필요하지 않습니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 공초점 현미경으로 FtsZ-sfGFP 돌연변이의 Z-링을 시각화했습니다.

Protocol

1. 세포 모델의 고려 사항 및 선택

참고: 시아노박테리아는 광합성 색소의 존재로 인해 강력한 자가형광을 가지고 있습니다. 이 신호는 스펙트럼의 빨간색 부분에 있으므로 시아노박테리아의 이미징에 적합한 형광 단백질은 적색 방출과는 거리가 먼 단백질입니다. 예를 들어 GFP, YFP, 금성, 청록색 및 BFP가 있습니다.

1. 표적 사상 시아노박테리아 균주에 존재하는 점술 성분을 선택합니다. 실험을 위해서는 형광 단백질에 융합된 선택된 점쟁이 성분을 발현하는 필라멘트 시아노박테리아 돌연변이체를 구성할 필요가 있습니다. 이 프로토콜에서, Anabaena sp. FstZ-sfGFP를 발현하는 돌연변이를 예로 들 수 있다. 이 균주는 E. coli¹¹과의 삼부모 교배에 의해 얻어졌습니다.
2. 사용할 돌연변이의 분리 수준을 확인하십시오. 실시예에서, 분리는 표적 유전자의 PCR 증폭에 의해 결정되었다. 이 프로토콜에 사용된 FtsZ-sfGFP 돌연변이체는 야생형 ftsZ 유전자가 결여된 완전히 분리된 균주입니다.

2. 성장 조건

1. 고정상( Anabaena sp.의 경우 25°C에서 일정한 빛에서 약 14일 동안 성장)에서 10mL 배양물을 사용하고 항생제가 보충된 BG11 배지 90mL(FtsZ-sfGFP 돌연변이의 경우 Spectinomycin 및 Streptomycin 10μl ^ml-1 )를 추가하여 돌연변이의 신선한 계대 배양을 만듭니다.
2. 지수 단계에 도달할 때까지 일정한 빛과 최적의 온도에서 새로운 세포 배양을 성장시킵니다. Anabaena sp.의 FtsZ-sfGFP 돌연변이체는 시료 전처리 전에 25°C에서 7일 동안 성장시킨다.

3. 아가로스 매트릭스에서의 샘플 준비

1. 균질화 된 성장 배양 물 2 mL를 취한다.
2. 실온에서 2,500 x g 로 10분 동안 원심분리합니다.
3. 한편, 50 mL 플라스크에서, BG11 액체 배지 중의 3% 저융점 아가로스의 30 mL를 가열하였다. 중간 전력 수준으로 설정된 전자레인지를 사용하고 완전히 녹을 때까지 15초마다 용액을 확인하십시오. 37°C로 식히기 위해 따로 보관하십시오.
   참고: 오염을 피하기 위해 아가로오스 용액을 오토클레이브합니다.
4. 원심분리가 완료되면 상층액 1.9mL를 버리고 위아래로 최소 3회 피펫팅하여 남은 부피의 세포를 다시 현탁합니다.
5. 재현탁된 세포를 900 μL의 3% 아가로스 용액과 혼합하여 위아래로 3회 이상 피펫팅한다.
   참고: 아가로스 용액은 액체여야 하지만 세포 손상을 방지하기 위해 너무 뜨겁지 않아야 합니다. 다음 단계는 아가로스 용액이 겔을 형성하기 전에 신속하게 수행되어야한다 = .
6. 1mL 주사기에서 아가로스 매트릭스를 조심스럽게 흡인합니다. 샘플이 주사기로 흡입되는 동안 기포가 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
   알림: 이 단계를 수행하기 전에 주사기 끝이 절단되어 좁은 입구 구멍을 제거했는지 확인하십시오.
7. 샘플-아가로스 혼합물을 실온에서 2시간 동안 수평 위치에 주사기를 놓음으로써 고형화시킨다.
8. 플런저를 사용하여 아가로스 매트릭스를 조심스럽게 제거하고 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다.
9. 응고된 샘플을 0.5 - 1 mm의 두께 범위에서 조각으로 절단하여 매트릭스의 무결성을 유지합니다.
   알림: 더 나은 결과를 얻으려면 메스나 얇은 면도날을 사용하여 아가로스 매트릭스를 자릅니다.
10. 슬라이스를 커버슬립에 나란히 놓습니다. 커버슬립의 디스크 수는 치수에 따라 다릅니다.
    참고: 타임랩스 현미경의 경우 현미경 분석용으로 만들어진 세포 챔버(예: Attofluor 또는 Chamlide 자기 챔버)를 사용하는 것이 좋습니다. 이 챔버는 탈수를 피하면서 샘플을 획득 할 수 있습니다. 이 예에서 샘플은 Attofluor 챔버를 사용하여 둥근 커버슬립(25mm)에서 준비됩니다.
11. 탈수를 방지하기 위해 챔버에 놓인 샘플에 녹인 3% 아가로스 용액 2mL를 추가합니다.
12. 아가로스 용액이 완전히 고형화되어 겔을 형성 할 때까지 기다리십시오.

4. 이미지 획득

1. 파라미터를 표준화하여 컨포칼 현미경에서 돌연변이 균주에서 관심 있는 형광 단백질을 시각화합니다. 현미경이 자가형광과 선택한 형광 마커를 모두 감지할 수 있는지 확인하십시오.
2. 최대 배율로 명시야 형태의 샘플을 시각화하고 그림 1과 같이 수직 방향의 필라멘트를 검색합니다.
3. Z 평면을 따라 자가형광 신호를 사용하여 초기 스캔으로 관심 분할 부위를 찾습니다.
4. 형광 단백질 마커의 파라미터를 사용하여 분열 부위에서 관심 단백질의 신호를 시각화합니다.
5. 생물학적 모델과 관심 단백질에 따라 타임랩스 실험을 수행합니다. 예를 들어, 이 경우 Anabaena sp.의 Z-링을 따라 FtsZ의 역학을 기록하기 위해 50초 동안 10초의 타임랩스 실험을 수행했습니다(그림 2).

Results

수직 고정화 방법을 사용한 Anabaena sp.의 Z-링 시각화
박테리아에서 Z-링 구성 요소의 역학을 연구하려면 수직 방향 세포에서 이미지를 획득해야 합니다. 이 위치에서 Z-링과 디비솜의 주요 단백질을 시각화하여 타임랩스 현미경으로 단백질 역학을 모니터링할 수 있습니다. 박테리아에 대한 고전적인 샘플 준비는 필라멘트 시아노박테리아에 대해 작동하지 않습니다. Anabaena sp.의 경우 필라멘트는 Z-링을 시각화할 수 없는 위치에 배향됩니다. 또한, 장기간에 걸쳐 단일 세포에서 세포 분열 단백질의 정확한 시각화를 위해 필라멘트를 고정된 상태로 유지하는 것은 불가능합니다. 따라서 Anabaena sp에서 FtsZ-sfGFP 돌연변이의 Z-링을 시각화하기 위해 LMP 아가로스와 샘플의 수평 배양을 사용하여 프로토콜을 개발하고 표준화했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 이전에 사용된 절차에 비해 더 높은 비율의 수직 방향 필라멘트를 얻을 수 있습니다...

Discussion

나뭇잎 단백질의 역학에 대한 연구는 의심할 여지 없이 도전 과제입니다. 특히, 필라멘트 시아노박테리아에서 과제 중 하나는 세포가 수직 방향이어야 하는 수평면에서 Z-링을 시각화하는 것입니다. 여기에서 설명한 방법을 사용하면 XY 평면에서 Z-링을 배치하여 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 Z-링의 완전한 시각화를 가능하게 하는 사상 시아노박테리아에 대한 최초의 간단한 방법입니다.

이 프로토콜은 간단하고 빠르지만, 저융점 아가로스는 세포 용액과 혼합하기에 충분히 유동적이어야 하기 때문에 아가로스 매트릭스에서 샘플 준비 단계 동안 특별한 주의를 기울여야 합니다. 동시에, 아가로스 용액은 세포 손상을 유발할 수 있기 때문에 너무 따뜻할 수 없습니다. 고려해야 할 또 다른 중요한 단계는 조심스럽게 수행하지 않으면 매트릭스가 붕괴되어 샘플이 손상될 수 있기 때문에 디스크 절단입니다.

이 방법을 사용하면 수직 위치의 필라멘트 비율...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml 주사기	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	일반적으로 액체 또는 주입 액체를 펌핑하는 데 사용되는 1ml 바늘이 있는 일회용 의료용 플라스틱 주사기는 이 실험에서 샘플을 빨아들이고 중합하는 데 사용됩니다.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	Attofluor Cell Camera는 정립 또는 도립 현미경에서 살아있는 세포 샘플을 볼 수 있도록 설계된 내구성 있고 실용적인 커버슬립 홀더입니다.
96웰 블록이 있는 Axygen MaxyGene II Thermal Cycler	CORNING	THERM-1001	새로운 MaxyGene II Thermal Cycler는 속도와 고급 기능을 향상시켜 Axygen 브랜드 제품에서 기대할 수 있는 프리미엄 성능을 제공합니다. 독특하고 유연한 프로그래밍. 빠른 실행 시간. 기존 그래디언트 사이클러에 비해 워크플로우가 개선되었습니다. 최대 5°C의 램핑 속도; C/초 조절 가능한 가열 뚜껑은 스트립, 튜브 및 마이크로 플레이트를 수용합니다.
Fisherbrand 커버 안경: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	두께와 크기가 균일한 최고급 광학 붕규산 유리로 제작되었습니다. 원형. 부식 방지.
Low Melting Point Agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade는 겔 전기영동 후 온전한 DNA 단편을 회수해야 하는 응용 분야에 이상적입니다.
Zeiss Airyscan Zeiss의 LSM 880 현미경		-	Zeiss Airyscan LSM 880 현미경은 해상도 한계(측면 해상도 ~ 120nm 및 축 해상도 ~ 350nm) 내에서 이미지를 획득할 수 있는 레이저 스캐닝 초점 현미경입니다. 이 검출기는 매우 민감하여 고속으로 초고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다.
마이크로센트리í fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	냉장 기능이 있는 표준 마이크로 원심분리기를 사용하여 일상적인 시료 준비 프로세스를 최대 17,000회까지 가속화합니다. 이 마이크로 원심분리기는 사용하기 쉽고 컴팩트한 디자인의 실험실 기기로 생산성, 다기능성, 안전성 및 편의성을 제공합니다.
니콘 타임랩스 현미경	니콘	-	니콘 C2 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경은 배양 챔버 덕분에 샘플을 8시간 이상 최적의 상태로 유지할 수 있기 때문에 장기 타임랩스에 이상적인 현미경입니다.
얇은 면도날 Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	얇은 면도날은 아가로스 매트릭스를 절단하는 데 사용되어 매트릭스의 무결성을 유지하면서 샘플이 포함된 디스크를 얻을 수 있습니다.