여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS) 기반 접근법은 자포동물-와편모충 공생의 대사 기초와 산호가 스트레스에 어떻게 반응하는지(즉, 온도로 인한 표백 중)를 설명하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 자포동물 숙주와 관련 미생물(Symbiodiniaceae 및 기타 원생생물, 박테리아, 고세균, 곰팡이 및 바이러스)로 구성된 산호 홀로비온트의 정상 상태 대사 산물 프로파일링은 산호의 전체적인 대사 상태를 특성화하기 위해 주변 및 스트레스 조건에서 성공적으로 적용되었습니다.
그러나 공생 상호 작용을 둘러싼 질문에 답하려면 산호 숙주와 조류 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 분석해야 하며, 이는 조직의 물리적 분리 및 분리에 의해서만 달성될 수 있으며 독립적인 추출 및 분석이 뒤따릅니다. 대사체학의 적용은 산호 분야에서 비교적 새로운 것이지만, 연구 그룹의 지속적인 노력으로 산호 숙주 조직과 조류 공생체의 분리를 포함하여 산호의 대사 산물을 분석하는 강력한 방법이 개발되었습니다.
이 백서는 고려해야 할 주요 최적화 단계를 포함하여 GC-MS 분석을 위한 홀로비온트 분리 및 대사 산물 추출에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 우리는 일단 독립적으로 분석되면 두 분획(산호 및 공생충과)의 결합된 대사 산물 프로필이 전체(홀로비온트)의 프로필과 유사하지만 조직을 분리함으로써 전체만으로는 얻을 수 없는 두 파트너의 대사 및 상호 작용에 대한 주요 정보를 얻을 수 있음을 보여줍니다.
서론
대사 산물은 세포 과정의 최종 산물을 나타내며, 대사체학(metabolomics)은 특정 유기체 또는 생태계에서 생산되는 대사 산물 모음에 대한 연구로 유기체 기능의 직접적인 측정을 제공할 수 있습니다1. 이는 생태계, 공생적 상호작용 및 복원 도구를 탐색하는 데 특히 중요한데, 대부분의 관리 전략의 목표는 특정 생태계 서비스 기능을 보존(또는 복원)하는 것이기 때문이다2. 산호초는 공생적 상호작용을 규명하고 산호의 생리적 반응을 군집 수준 및 생태계 수준의 영향과 연결하기 위한 대사체학의 잠재적 가치를 보여주는 하나의 수생 생태계이다3. 고처리량 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)의 응용 분야는 높은 선택성과 감도로 광범위한 대사산물 클래스를 동시에 신속하게 분석하고, 스펙트럼 라이브러리를 사용할 수 있을 때 신속한 화합물 식별을 제공하며, 상대적으로 낮은 시료당 비용으로 높은 수준의 재현성과 정확도를 제공할 수 있기 때문에 특히 가치가 있습니다.
산호는 산호 동물, 광합성 와편모충 내공생체(과: Symbiodiniaceae4) 및 복잡한 마이크로바이옴
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프로토콜
참고: 실험 설계, 샘플 수집 및 보관은 2,30,31의 다른 곳에서 자세히 설명되었습니다. 야생 산호 채취에 대한 허가 승인은 채취 및 실험 전에 받아야 합니다. 이곳의 샘플은 바타비아 산호 농장(워싱턴 주 제럴턴)에서 수입된 몬티포라 몰리스(Montipora mollis, 녹색 형태) 군락에서 채취한 것으로, 원래는 양식 허가 AQ1643에 따라 수심 1m의 아브로로스 제도(Abrohlos Islands; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E)의 암초에서 채취한 것입니다. 샘플링 전에 콜로니는 35 PSU의 800 L 수족관에서, 150 μmol 광자·m−2·s−1의 청색광 및 백색광 아래에서, 그리고 25 °C ± 0.5 °C에서 3개월 동안 보관되었습니다. 산호 조각(~5cm2, N=6)을 액체 질소에서 급속 냉동하고 처리할 때까지 -80°C에서 보관하였다.
1. 추출 용액 및 장비의 준비
- 산호 조직 제거 최소 1일 전에 추출 용액과 장비....
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결과
이 작업 중에 생성된 모든 데이터는 보충 정보에서 사용할 수 있습니다.
숙주-공생체 분리
그림 1: 산호 숙주 조직과 Symbiodiniaceae 세포의 분리 설정 및 검증. (A) 산호 골격에서 산호 조직을 제거하기 위한 에어건 설정. 피펫 팁은 전기 테이프로 에어건에 부착되고 팁에서 작은(~5mm) 섹션이 절단되어 팁을 빼지 않고 더 많은 공기가 빠져나갈 수 있습니다. (B) 홀로비온트와 분리된 숙주 조직(상등액) 및 공생충과(S.......
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토론
숙주와 공생체의 분리는 간단한 원심분리를 통해 쉽고 빠르게 달성할 수 있으며, 여기의 결과는 분획을 분리하는 것이 특정 홀로비온트 구성원 기여를 나타내는 귀중한 정보를 제공할 수 있음을 보여주며, 이는 산호 건강의 기능적 분석에 기여할 수 있습니다. 성체 산호에서, 지질 합성은 주로 상주 조류 공생체(40)에 의해 수행되는데, 이 공생체는 지질(예를 들어, 트리아실글리세롤 및 인지질)41 및 스트레스 회복을 촉진할 수 있는 지방산을 공급한다11,42. 이 연구에서 공생체 대 숙주 프로필에서 더 풍부한 13 개의 대사 산물 중 9 개는 생물학적으로 관련된 eicosanoids DHA (C22 : 6 [ω-6]), EPA (C20 : 5 [ω-6]) 및 ARA (C20 : 4 [ω-6])를 포함하여 지방산이었으며.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
J.L.M.은 UTS Chancellor's Research Fellowship의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100% LC 등급 메탄올 | Merck | 439193 | LC 등급 필수 |
| 2 mL 마이크로 원심분리 튜브, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene은 화학물질, 기계적 응력 및 극한의 온도에 대한 높은 저항성을 제공합니다. |
| 2030 Shimadzu 가스 크로마토그래프 | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µ m 산 세척 유리 구슬 | Merck | G1152 | 이 크기는 Symbiodiniaceae 세포를 파괴하는 데 최적입니다 |
| AOC-6000 Plus 다기능 자동 샘플러 | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford 시약 | Merck | B6916 | 모든 단백질 비색 시약이 허용됩니다 |
| 압축 공기총 | Ozito | 6270636 | 유사한 디자인이 허용됩니다. 1mL 팁을 맞을 수 있는 피팅을 갖추는 것이 중요합니다. |
| 0.25mm 내경의 컬럼과 1 µ를 포함한 DB-5 컬럼; m 필름 두께 | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C 및/또는 13C5– 15N 발린 | , 머크 | 605514/ 600148 | 메탄올에 내부 표준물질 중 하나 또는 둘 다를 첨가할 수 있습니다. |
| 평평한 바닥 96웰 플레이트 | Merck | CLS3614 | |
| 유리 섬광 바이알 | Merck | V7130 | 20mL, 비플라스틱 씰 포함 |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | 사용할 수 없는 경우 소 혈청 알부민 허용 |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight 소프트웨어 | v3.6 | ||
| 수산화나트륨 | Merck | S5881 | 펠릿 1 M 용액 |
| tidyverse | v1.3.1 | R 패키지 | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | 또는 이와 유사한 |
| TQ8050NX 삼중 사중극자 질량 분석기 | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 웰 플레이트 | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak 샘플 백 | Merck | WPB01018WA | 샘플 수집 백; 크기 : ~ 5cm 산호 조각을 수용 할 수있을만큼 충분히 크지 만 물이 너무 퍼질 정도로 크지 않습니다 |
참고문헌
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Bea....
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