방법 논문

면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(Digital Image Analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼

DOI:

10.3791/65643

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2023년 10월 13일

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1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics, Fertility Center, Shenzhen Zhongshan Urology Hospital, 2Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center, Co., Ltd.

이 논문에서

요약

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여기에서 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발하여 착상 기간 동안 유산이 재발한 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있도록 검증했습니다.

초록

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재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 황체 중기 동안 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발 및 검증했습니다. 모든 자궁내막 샘플은 월경 주기의 황체 중기에 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 절단하고, CD56+ uNK 세포, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 면역조직화학(IHC) 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔했으며 정량 분석을 위해 상용 이미지 분석 시스템을 사용했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율은 전체 자궁내막세포의 면역세포 수를 나누어 계산하였다. 상용 영상 분석 시스템을 이용하면 기존의 영상 분석으로는 분석이 어렵거나 불가능했던 자궁내막 면역세포의 정량 평가를 쉽고 정확하게 분석할 수 있습니다. 이 방법론은 면역 세포 간의 상호 작용과 다양한 생식 부전 환자에 대한 이질성을 포함하여 자궁 내막 미세 환경을 정량적으로 특성화하는 데 적용할 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 플랫폼은 RM 환자의 진단 및 치료에 중요한 임상적 중요성을 가질 수 있습니다.

서론

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재발성 유산(RM)은 두 번 이상의 연속적인 임신을 상실하는 것으로, 최근 몇 년 동안 임상의들의 관심을 끌고 있는 복잡한 질병입니다. 가임기 여성의 RM 발생률은 1%-5%입니다 1. 이전 연구의 결과는 면역 요인이 RM 2,3,4,5의 발병과 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 모체-태아 계면에서 면역 항상성을 유지하는 것은 배아 착상과 발달에 필요합니다. 자궁내막 면역세포는 영양세포 침범 촉진, 나선형 동맥 개조, 태반 발달에 기여하는 등 이러한 항상성을 유지하기 위해 여러 가지 조절 역할을 수행합니다 6,7,8,9.

RM이 있는 여성의 비정상적인 자궁내막 면역 세포는 이전에 보고된 바 있습니다. 결과는 자궁 자연 살해 세포(uNK)의 고밀도와....

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프로토콜

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연구 내용과 프로토콜은 Shenzhen Zhongshan Urology Hospital의 연구 윤리 위원회에서 윤리적으로 검토하고 승인했습니다. 연구에 참여한 모든 여성(20-40세)은 샘플 수집 및 사용에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 병리조직의 획득

  1. 조직 채취를 위한 도구, 즉 측정 자, 핀셋, 임베딩 카세트, 임베딩 용지 및 티슈 바구니를 준비합니다.
  2. 피펠 카테터와 함께 표준 접근법을 사용하여 수집된 자궁내막 조직(녹두보다 큼)의 양이 충분한지 관찰합니다.
  3. 포르말린에서 자궁내막 조직을 핀셋으로 임베딩 페이퍼에 옮기고 자로 자궁내막 조직 치수를 측정합니다.
  4. 자궁내막 조직을 임베딩 페이퍼로 감싸고 임베딩 카세트에 넣습니다.
  5. 탈수를 위해 임베딩 카세트를 티슈 바스켓에 넣습니다.

2. 조직 탈수

  1. 티슈 바스켓을 탈수기의 반응 챔버에 넣고 ( 재료 표 참조) 일상적인 조직 탈수 절차를 시작합니다 : 포르말린 100 분; 100분 동안 포르말린; 60분 동안 75% 알코올; 60....

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결과

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자궁내막 면역세포를 정량적으로 평가하고 인위적인 조작 실수로 인한 불안정성을 줄이기 위해 자동 면역조직화학적 검출 및 디지털 정량 평가 시스템을 사용하여 자궁내막 면역세포에 대한 디지털 정량 분석 플랫폼을 구축했습니다. 이식 기간 동안 재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위해 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축하였습니다. 모든 자궁내막 조직은 생리 주기의 황체 중기 동안 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 분할하고, CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD163+M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 IHC 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔하고 디지털 이미지 분석 시스템을 사용하여 정량 분석을 수행했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율을 계산하기 위해서는.......

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토론

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이 프로토콜은 RM 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축했습니다. 여기에서 RM 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 6개의 자궁내막 면역 마커를 검출했습니다.

황체 중기의 수용성 자궁내막은 성공적인 착상과 임신의 핵심이다27,28. 따라서 자궁내막 면역세포의 비율은 자궁내막 수용성을 추정하는 데 중요한 역할을 합니다. 자궁내막 면역 세포 분석은 기존의 병리학적 방법으로 예측하기 때문에 임상 적용에 도움이 되지 않습니다. 현재 면역 세포 비율을 측정하기 위한 표준화된 방법이 없어 임신 중 면역 세포 비율의 역할을 이해하는 데 장벽이 되고 있습니다. 기존의 IHC 분석은 선택된 시야와 수동 카운팅을 기반으로 합니다. 면역 세포의 정확한 조직 분할 및 국소화는 수동 분석이 주관적이기 때문에 기존 IHC로 평가할 .......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자들은 이 연구에 동의하고 샘플을 기증한 모든 여성들에게 감사한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자동 커버슬리퍼사쿠라우스DRS-Prisma-P-JCS& Film-JC2
CD163GrowGn 생명공학NCL-L-CD163
CD1a유전자 기술GM357129
CD56유전자 기술GT200529
CD8NovocastraNCL-L-CD8-4B11
탈수기Thermo FisherExcelsior ES
디지털 병리학 및인디카 실험실HALO
Foxp3YILIFANG 생물학14-477-82
IHC 염색기LeicaBOND III
이미지 분석 플랫폼인디카 연구소HALO
슬라이드 스캐너올림푸스 생명 과학VS200

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
  2. Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss.

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