인도시아닌 녹색 혈관 조영술에 의한 신생혈관 연령 관련 황반변성의 혈관 형태 특성 분석

연령 관련 황반 변성(AMD)은 노인에게 심각한 시력 상실을 초래하는 흔한 질환입니다¹. 미국에서만 AMD 환자 수가 현재 1,100만 명에서 2050년까지 거의 2,200만 명에 달할 것으로 예상됩니다. 전 세계적으로 AMD 확진자 수는 2040년까지 무려 2억 8,800만 명에 이를 것으로 예상됩니다².

"습성" 또는 신생혈관성 AMD라고도 알려진 맥락막 신생혈관형성(CNV)은 중앙 망막 아래에 비정상적인 혈관이 형성되어 시력에 치명적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 출혈, 망막 삼출 및 심각한 시력 상실이 발생합니다. 세포외 VEGF를 표적으로 하는 항혈관내피성장인자(VEGF) 치료제의 도입은 CNV 치료에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 최대 50%의 환자가 이러한 치료법에 대해 차선의 반응을 보이며, 체액 축적 및 해결되지 않은 출혈 또는 새로운 출혈과 같은 지속적인 질병 활동을 보인다 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

임상 연구에 따르면 CNV 환자에서 항-VEGF 내성은 종종 대구경 분지 세동맥, 혈관 루프 및 문합 연결을 특징으로 하는 세동맥 CNV의 존재와 일치한다⁹. 반복적인 항-VEGF 치료는 혈관 이상화, 동맥 CNV의 발달, 그리고 궁극적으로 항-VEGF 요법에 대한 내성에 기여할 수 있다^14,15. 동맥 CNV의 경우, 동정맥 문합 루프에서 부적절하게 형성된 단단한 접합부, 특히 혈류량이 높은 조건에서 삼출액이 증가하여 지속적인 체액 누출이 발생할 수 있다⁹. 반대로, 항-VEGF 치료에 잘 반응하는 개인은 모세혈관 CNV를 나타내는 경향이 있습니다.

동물 모델을 이용한 우리의 연구에서, 우리는 나이 든 쥐에서 레이저 유도 CNV가 동맥 CNV를 개발하고 anti-VEGF 치료에 대한 내성을 나타낸다는 것을 입증했다^16,17. 반대로, 젊은 마우스에서 레이저 유도 CNV는 모세관 CNV의 발달과 항-VEGF 치료에 대한 높은 반응성으로 이어집니다. 따라서 기계론적 및 치료적 연구를 위해 CNV 혈관 유형을 구별하는 것이 중요합니다.

임상 환경에서 CNV는 일반적으로 플루오레세인 염료를 사용하여 삼출물을 추적하고 병리학적 누출 영역을 식별하는 형광 혈관 조영술(FA) 누출 패턴(예: 유형 1, 유형 2)을 기반으로 분류됩니다. AMD 연구에서 CNV는 주로 동물 모델에서 FA를 사용하여 연구됩니다. 그러나 FA는 CNV의 혈관 형태를 밝히지 못했습니다. 또한 FA는 가시광선 스펙트럼의 이미지만 캡처하고 망막 색소 상피(RPE) 아래의 맥락막 혈관을 시각화할 수 없습니다. 대조적으로, 혈장 단백질에 대한 강한 친화력을 나타내는 인도시아닌 그린(ICG)은 우세한 혈관 내 유지를 촉진하고 혈관 구조와 혈류의 시각화를 가능하게 한다⁹. ICG의 근적외선 형광 특성을 활용하여 ICG 혈관 조영술(ICGA)을 사용하여 망막 및 맥락막 색소를 이미지화할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 FA와 ICGA를 결합하여 모세혈관 및 세동맥 CNV가 관찰되는 젊은 마우스와 늙은 마우스에서 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV)의 누출 및 혈관 형태를 조사하는 프로토콜이 제시됩니다.

이 연구에서 수행된 동물 실험은 베일러 의과대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서에 설명된 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 영(7-9주) 및 늙은(12-16개월) C57BL/6J 수컷 및 암컷 마우스가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).

1. 이미징 시스템 준비

1. 이미징 플랫폼에 가열 패드를 놓고( 재료 표 참조) 이미징 중에 마우스의 체온이 유지되도록 합니다. 가열 패드를 활성화하고 온도를 35°C로 조정합니다.
2. 먼지 덮개를 제거하고 레이저 스캐닝 검안경을 켭니다. 기기에 55° 렌즈를 놓습니다.
3. 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설정하고 유전자형, 성별, 나이 등을 포함한 필수 정보를 입력합니다. 이미징 세션이 시작되면 ICGA 이미지 캡처를 위한 IR (적외선 채널)을 선택합니다.

2. ICGA 및 FA 전 동물 준비

1. 마우스의 무게를 측정하여 필요한 마취량(케타민/자일라진 70-100/2.5-10mg/kg, 재료 표 참조)을 결정합니다.
   참고: 대사 프로필이 마우스 균주에 따라 다르기 때문에 복용량을 최적화하는 것이 중요합니다. 이미징을 완료하기 전에 쥐가 깨어나지 않도록 적절한 투여량을 결정하거나 과다 투여 및 잠재적인 동물 폐사의 위험을 방지하는 것이 중요합니다.
2. 30-32G 바늘이 있는 1mL 멸균 주사기를 사용하여 복강 내 주사로 마취를 전달합니다. 쥐의 발 중 하나를 부드럽게 꼬집어 쥐가 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 동물이 반응이나 움직임을 보이면 다음 단계로 진행하기 전에 추가 시간을 기다리는 것이 좋습니다. 이를 통해 동물이 정착하고 후속 절차를 위한 최적의 조건을 보장할 수 있습니다.
3. 1% 트로피카미드 점안액을 투여하여 쥐의 양쪽 눈을 확장시킵니다. 눈의 움직임과 눈 깜빡임을 줄이기 위해 양쪽 눈에 0.5% 프로파라카인 염산염 방울( 재료 표 참조)을 사용하기 전에 최소 30초 동안 기다리십시오. 윤활제 아이젤 방울을 바릅니다.
   알림: 전체 마취 기간 동안 각막 혼탁으로 이어질 수 있는 쥐 눈의 극심한 건조 문제를 해결하는 것이 중요합니다. 이러한 불투명도는 가시성 방해로 인해 후속 이미징을 어렵게 만듭니다. 이를 예방하려면 윤활제 아이젤 안안액을 지속적으로 사용하여 쥐의 눈을 촉촉하게 유지하는 것이 중요합니다.
4. 가열 물 패드에 마우스를 놓습니다.
   알림: 마우스는 표면적 대 부피 비율이 높아 환경에 대한 열 손실이 증가합니다. 마취로 인한 온도 강하와 결합하면 마우스에 상당한 위험을 초래할 수 있으며 잠재적으로 저체온증으로 인한 사망으로 이어질 수 있습니다. 저체온증을 예방하고 시술 중 쥐의 건강을 보장하기 위해 필요한 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.
5. 2mg/mL ICG와 20mg/mL 플루오레세인 염료의 1:1 부피 혼합물을 준비합니다( 재료 표 참조). 1mL 주사기와 32G 바늘을 사용하여 복강 내 주사를 통해 혼합물 250μL를 투여합니다.
   1. 장기에 구멍이 뚫리지 않도록 뒷다리 근처 쥐 복부의 왼쪽 하단 사분면에 바늘을 쥐의 피부와 평행한 각도로 삽입합니다.
   2. 플런저를 조심스럽게 빼내고 주사기 캡에 피가 들어가지 않았는지 확인합니다. 일정한 속도를 유지하면서 천천히 꾸준히 염료를 주입합니다.
      알림: ICG 염료는 사용하기 전에 0.22μm 주사기 필터로 여과해야 합니다.

3. ICGA와 FA

1. 이미징 플랫폼의 가열 패드에 마우스를 올려 놓으면 이미징이 시작됩니다.
2. 마우스 몸체를 카메라에 대해 45도 각도로 배치하고 머리를 약간 아래쪽으로 회전합니다. 이를 통해 시신경이 카메라 초점의 중심에 위치할 수 있습니다.
3. 면봉을 사용하여 눈을 섬세하게 닦아 먼저 촬영할 눈의 윤활제 점안액 또는 젤 층을 제거합니다. 이미징 절차를 완료한 직후 윤활유 젤 방울을 도포해야 합니다.
   알림: 마취 상태에서 윤활 없이 눈을 1분 이상 방치하는 것은 권장하지 않습니다.
4. 카메라를 마우스 눈 쪽으로 움직입니다. 획득 모듈에서 FA 채널을 선택합니다. FA 채널에서 방출되는 발광은 더 빠른 배치를 위해 쥐 각막 중앙에 배치하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 레이저 스캐닝 검안경을 비스듬히 기울일 필요가 없도록 시신경이 화면 중앙에 오도록 마우스의 머리를 배치합니다. 마우스의 머리 위치를 약간 조정하여 원하는 정렬을 얻습니다.
6. 수집 모듈에서 ICGA 채널을 선택합니다. 레이저 강도가 100%로 설정되어 있는지 확인하고 적절한 렌즈와 일치하는 55° 옵션을 선택합니다. 이렇게 하면 레이저 스캐닝 검안경에 대한 최적의 설정이 보장됩니다.
   알림: 과포화를 방지하려면 초기 단계를 이미징할 때 일반적으로 약 25%-50%의 낮은 레이저 강도를 사용해야 할 수 있습니다. 이 범위에서 레이저 강도를 조정하면 과포화 없이 선명하고 정확한 이미지를 캡처하는 데 도움이 될 수 있습니다.
7. 눈이 이미징 소프트웨어의 전체 화면을 차지할 때 감도 및 초점 설정을 조정하여 CNV 멤브레인의 가장 선명한 이미지를 얻습니다.
   1. 획득 모듈의 둥근 검은색 버튼을 돌려 이미지의 감도를 조정합니다.
   2. 검안경의 손잡이 를 돌려 초점을 조정합니다. FA를 사용하여 망막 혈관을 시각화하기 위한 최적의 초점은 일반적으로 35-45D(디옵터) 범위 내에 있습니다. 반면에 ICGA를 사용하여 맥락막을 시각화하기 위한 이상적인 초점은 일반적으로 10-15D 사이입니다.
      참고: CNV 멤브레인의 크기가 다르기 때문에 혈관 형태에 대한 최적의 이미징을 얻기 위해 초점을 10-30D로 조정해야 할 수도 있습니다.
8. 최상의 이미지를 얻기 위해 초점과 감도를 조정한 후에는 획득 모듈의 둥근 검은색 버튼을 눌러 이미지를 정규화합니다. 정규화가 완료되면(모든 프레임 캡처) 터치스크린 패널에서 획득 버튼을 클릭하여 이미지를 저장합니다. 다른 각도에서 CNV를 촬영하기 위해 카메라를 움직여야 할 수도 있습니다. 또한 CNV 병변의 최상의 이미지를 제공하기 위해 마우스를 다른 위치로 향하게 할 수 있습니다.
   알림: 시신경에서 더 멀리 떨어진 혈관을 볼 때 레이저 스캐닝 검안경의 초점이나 위치를 재조정해야 할 수도 있습니다.
9. 획득 모듈을 사용하여 FA 채널 로 다시 전환합니다. 3.6-3.7단계에 나열된 것과 동일한 단계를 완료하여 CNV 병변의 누출을 캡처하기 위해 각 이미지의 감도와 초점을 조정합니다.
   알림: CNV 누출의 과포화를 방지하고 누출 영역을 인위적으로 늘리기 위해 올바른 감도를 선택했는지 확인하십시오.
10. 주입 후 3-4분 동안 ICGA 및 FA의 "초기 단계"를 이미지화합니다.
    참고: "초기 단계"는 맥락막 혈관을 명확하고 뚜렷하게 볼 수 있는 시기입니다. 일반적으로 4-8분 사이에 발생하는 중간 단계에서는 망막과 맥락막 혈관이 훨씬 더 희미해지고 확산됩니다. 말기(>8-10분)가 시작되면 맥락막과 망막이 모두 분간할 수 없게 됩니다. 그러나 과형광 CNV 병변은 감소된 배경에 대해 최대한의 대비를 나타냅니다. 이러한 언급된 시기는 가변적이며 주입된 ICG 염료의 농도와 양에 따라 다릅니다. ICG 염료의 양이 많을수록 각 단계의 타임라인이 증가하고 더 뚜렷한 용기를 제공하는 경향이 있습니다. 단계는 절대 시간이 아닌 위에 나열된 주요 기능을 기반으로 정의해야 합니다.
11. 모든 이미지가 획득되면 생쥐의 눈에 젤 윤활제 또는 연고를 바르고 발열 패드에서 생쥐의 회복을 주의 깊게 모니터링합니다. 마우스가 완전히 복구되는 데 일반적으로 1.5시간이 걸립니다.
12. 쥐가 마취에서 완전히 회복되고 깨어나면 케이지와 지정된 보관 구역에 다시 넣습니다.
13. 이미징 시스템과 레이저를 종료하기 전에 후속 분석을 위해 이미지를 TIFF 또는 JPEG 파일로 내보냅니다.

4. RPE/choroid 편평하 산 및 얼룩

1. 밤새 4% 파라포름알데히드에 눈을 고정합니다. PBS로 눈을 세 번 씻으십시오. 수정체와 각막을 제거합니다.
2. 차단 용액(10% 소 혈청 알부민, PBS의 0.6% Triton X-100)에서 실온에서 1시간 동안 눈을 배양합니다. PBS 세척을 세 번 반복합니다.
3. 차단 용액에서 이솔렉틴 GS-IB4 Alexa-flour 568 접합체 및 항α평활근 액틴 항체( 재료 표 참조)로 눈을 밤새 배양합니다.
4. PBS로 세 번 씻으십시오. Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit 2차 항체( 재료 표 참조)로 샘플을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
5. 가장자리에서 적도까지 4개의 방사형 절단을 수행합니다. 망막¹⁷을 조심스럽게 제거합니다.
   알림: 신생혈관막이 우발적으로 분리되지 않도록 주의해야 합니다.
6. 평평하게 장착된 코로이드를 유리 슬라이드에 장착합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 CNV를 시각화합니다.

프로토콜에 따라, ICGA 및 FA는 젊은(7-9주) 및 늙은(12-16개월) C57BL/6J 마우스에서 레이저 유도 CNV에 대해 수행되었습니다. FA는 CNV 병변의 위치 및 누출에 대한 정보를 제공하는 반면(그림 1, 왼쪽 패널), ICGA는 CNV 병변의 혈관 형태를 보여줍니다(그림 1, 오른쪽 패널). 어린 쥐에서는 모세혈관 CNV가 CNV 병변을 지배합니다. 대조적으로, 늙은 쥐는 큰 구경의 혈관, 혈관 루프 및 문합 연결을 특징으로 하는 동맥 CNV를 나타냅니다. 젊은 마우스와 늙은 마우스 모두 FA에서 망막 혈관 구조의 명확한 가시성을 보여줍니다(그림 1, 왼쪽 패널). 어린 쥐의 ICGA 이미지에서는 망막 혈관이 보이지 않고 맥락막이 희미하게 나타나 맥락막 혈관에 초점을 맞춘 ICGA의 중간 단계를 나타냅니다. 늙은 쥐의 ICGA 이미지에서 부분적인 망막 혈관 구조는 관찰되지만 맥락막은 희미하게 보이며, 이는 늙은 쥐에서 세동맥 CNV의 크기가 더 크기 때문에 망막과 맥락막 사이에 초점이 맞춰진 중간 단계를 시사합니다. 늙은 쥐의 세동맥 CNV는 젊은 쥐의 모세관 CNV에 비해 더 큰 CNV 크기(그림 2)와 훨씬 더 많은 누출을 나타냅니다. 항평활근 액틴 항체를 사용한 면역염색은 늙은 쥐의 CNV 혈관을 광범위하게 표지하여 세동맥 형태를 확인합니다(그림 3). 대조적으로, α-평활근 액틴에 의한 최소 염색은 모세관 형태와 일치하는 어린 마우스의 병변 부위 혈관에서 관찰됩니다.

그림 1: 젊은 쥐와 늙은 쥐의 레이저 유도 CNV를 묘사한 FA 및 ICGA 이미지 비교. FA 이미지는 CNV 병변의 누출을 표시하는 반면 ICGA는 혈관 형태를 시각화합니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: ICGA 이미지를 기반으로 한 젊은 마우스와 늙은 마우스의 CNV 병변 크기 정량화. CNV 영역을 측정하여 젊은 마우스와 늙은 마우스에서 각각 총 26개 및 14개의 레이저 스폿을 분석했습니다. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 통계 분석은 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. P < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: RPE/맥락막 플랫 마운트에서 Alexa 568 이솔렉틴 및 항α평활근 액틴 항체와 함께 표지된 젊은 마우스와 늙은 마우스의 CNV 병변의 대표 이미지. 빨간색은 Alexa 568 이솔렉틴을 나타내고 녹색은 α평활근 액틴(SMA)을 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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