현재 형광 혈관 조영술(FA)은 맥락막 신생혈관 형성(CNV)의 동물 모델에서 누출 패턴을 식별하는 데 선호되는 방법입니다. 그러나 FA는 혈관 형태에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델에서 레이저 유도 CNV의 다양한 병변 유형을 특성화하기 위해 인도시아닌 녹색 혈관 조영술(ICGA)을 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
연령 관련 황반 변성(AMD)은 노인 실명의 주요 원인이며 인구 고령화로 인해 유병률이 빠르게 증가하고 있습니다. 맥락막 신생혈관 형성(CNV) 또는 습성 AMD는 모든 AMD 사례의 10%-20%를 차지하며, AMD 관련 실명의 80%-90%를 차지합니다. 현재의 항-VEGF 치료법은 환자의 약 50%에서 차선의 반응을 보인다. CNV 환자에서 항-VEGF 치료에 대한 내성은 종종 동맥 CNV와 관련이 있는 반면, 반응자는 모세혈관 CNV를 갖는 경향이 있다. 플루오레세인 혈관 조영술(FA)은 습성 AMD 환자 및 동물 모델의 누출 패턴을 평가하는 데 일반적으로 사용되지만, CNV 혈관 형태(세동맥 CNV 대 모세혈관 CNV)에 대한 정보는 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 레이저 유도 CNV 마우스 모델의 병변 유형을 특성화하기 위해 인도시아닌 녹색 혈관 조영술(ICGA)을 사용하는 방법을 소개합니다. 이 방법은 습성 AMD에서 항-VEGF 내성에 대한 메커니즘과 치료 전략을 조사하는 데 중요합니다. 기계론 및 치료 연구에서 CNV의 누출 및 혈관 특징에 대한 포괄적인 평가를 위해 FA와 함께 ICGA를 통합하는 것이 좋습니다.
서론
연령 관련 황반 변성(AMD)은 노인에게 심각한 시력 상실을 초래하는 흔한 질환입니다1. 미국에서만 AMD 환자 수가 현재 1,100만 명에서 2050년까지 거의 2,200만 명에 달할 것으로 예상됩니다. 전 세계적으로 AMD 확진자 수는 2040년까지 무려 2억 8,800만 명에 이를 것으로 예상됩니다2.
"습성" 또는 신생혈관성 AMD라고도 알려진 맥락막 신생혈관형성(CNV)은 중앙 망막 아래에 비정상적인 혈관이 형성되어 시력에 치명적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 출혈, 망막 삼출 및 심각한 시력 상실이 발생합니다. 세포외 VEGF를 표적으로 하는 항혈관내피성장인자(VEGF) 치료제의 도입은 CNV 치료에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 최대 50%의 환자가 이러한 치료법에 대해 차선의 반응을 보이며, 체액 축적 및 해결되지 않은 출혈 또는 새로운 출혈과 같은 지속적인 질병 활동을 보인다 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
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프로토콜
이 연구에서 수행된 동물 실험은 베일러 의과대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서에 설명된 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 영(7-9주) 및 늙은(12-16개월) C57BL/6J 수컷 및 암컷 마우스가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).
1. 이미징 시스템 준비
- 이미징 플랫폼에 가열 패드를 놓고( 재료 표 참조) 이미징 중에 마우스의 체온이 유지되도록 합니다. 가열 패드를 활성화하고 온도를 35°C로 조정합니다.
- 먼지 덮개를 제거하고 레이저 스캐닝 검안경을 켭니다. 기기에 55° 렌즈를 놓습니다.
- 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설정하고 유전자형, 성별, 나이 등을 포함한 필수 정보를 입력합니다. 이미징 세션이 시작되면 ICGA 이미지 캡처를 위한 IR ....
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결과
프로토콜에 따라, ICGA 및 FA는 젊은(7-9주) 및 늙은(12-16개월) C57BL/6J 마우스에서 레이저 유도 CNV에 대해 수행되었습니다. FA는 CNV 병변의 위치 및 누출에 대한 정보를 제공하는 반면(그림 1, 왼쪽 패널), ICGA는 CNV 병변의 혈관 형태를 보여줍니다(그림 1, 오른쪽 패널). 어린 쥐에서는 모세혈관 CNV가 CNV 병변을 지배합니다. 대조적으로, 늙은 쥐는 큰 구경의 혈관, 혈관 루프 및 문합 연결을 특징으로 하는 동맥 CNV를 나타냅니다. 젊은 마우스와 늙은 마우스 모두 FA에서 망막 혈관 구조의 명확한 가시성을 보여줍니다(그림 1, 왼쪽 패널). 어린 쥐의 ICGA 이미지에서는 망막 혈관이 보이지 않고 맥락막이 희미하게 나타나 맥락막 혈관에 초점을 맞춘 ICGA의 중간 단계를 나타냅니다. 늙은 쥐의 ICGA 이미지에서 부분적인 망막.......
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토론
이 연구는 레이저 유도 CNV가 있는 마우스 모델에서 세동맥 및 모세관 맥락막 신생혈관화(CNV)의 혈관 형태를 식별하기 위해 인도시아닌 녹색 혈관 조영술(ICGA)을 사용하는 것을 보여주었습니다. 인도시아닌 그린(ICG) 염료의 헤모글로빈 결합 및 적외선 특성은 현재 연구 커뮤니티에서 사용하는 방법인 형광 혈관 조영술(FA)을 사용하여 달성하기 어려운 CNV 형태를 검출할 수 있게 했습니다.
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 염료가 장기를 관통하지 않고 복강내 구멍에 주입되도록 하는 것입니다. 왼쪽 아래 사분면에 적절한 주사 배치, 피부와 경사 사이의 작은 각도, 전체 바늘의 삽입을 피하면서 인도시아닌 염료의 흡수를 향상시킬 수 있습니다. 염료를 장기에 주입하면 흡수가 느려지고 복부 장기의 열상, 내부 출혈 또는 감염과 같은 잠재적인 합병증이 발생할 수 있습니다. 이 절차의 또 다른 중요한 측면은 눈의 전체 직경을 보기 위해 이미지를 획득하기 전에 시신경을 중앙에 두는 것입니다.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 BrightFocus Foundation, Retina Research Foundation, Mullen Foundation, Sarah Campbell Blaffer Endowment in Ophthalmology의 YF 보조금, Baylor College of Medicine의 NIH 핵심 보조금 2P30EY002520, Baylor College of Medicine의 안과학과에 대한 Research to Prevent Blindness의 무제한 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 32-G 인슐린 주사기 | MHC 의료 제품 | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 염소 항토끼 보조 항체 | Invitrogen | A11008 | |
| 안티-&알파; 평활근 액틴 항체 | Abcam | ab5694 | |
| 소 혈청 알부민 | 산타 크루즈 생명 공학, Inc. | 사우스캐롤라이나-2323 | |
| C57BL / 6J 마우스 (7-9 주) | Jackson Laboratory | Strain # : 000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T 펌프 열 요법 시스템 | Gaymar | TP-500 | 이미징 후 마우스 복구를위한 물 순환 열 펌프 |
| Genteal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 콘주게이트 | Invitrogen | I21412 | |
| 하이델베르크 Eye Explorerer | 하이델베르크 엔지니어링, 독일 | HEYEX2 | |
| 인도시아닌 그린 | Pfaultz & 바우어 | I01250 | |
| 케타민 | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| 파라포름알데히드 | 아크로스 유기물 | ||
| Proparacaine Hydrochloride 안과 솔루션 (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis 다중 양식 이미징 시스템 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | 시그마-알드리치 | X100-1L | |
| 트로피카미드 점안액 (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | 동공 확장용 |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
참고문헌
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and diseas....
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재인쇄 및 허가
