정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 신속 진단

H. pylori는 나선형의 운동성이 높은 그람 음성 박테리아로 주로 위의 유문 부위에 서식합니다¹. 전 세계 인구의 거의 50%를 감염시키는 흔한 병원체이다². 헬리코박터 파일로리 감염 환자는 대부분 임상 증상이 나타나지 않으며, 감염 후 수년이 지나면 만성 위염, 소화성 궤양, 위궤양, 위암 등 다양한 질병이 발병한다³. 다양한 집단을 기반으로 한 여러 연구에서 위암 및 전암성 병변을 예방하기 위한 H. pylori 제거 효능이 입증되었습니다 ^4,5. 따라서 세계보건기구(WHO) 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer)는 예방책으로 헬리코박터스 파일로리(H. pylori) 박멸을 권고하고^{있다 6}.

H. pylori 감염을 식별하기 위해 비침습적 방법을 사용하는 것은 대부분의 무증상 소화불량 환자를 위한 치료의 핵심 요소입니다. 요소 호흡 검사(UBT), H. pylori 분변 항원 검사(SAT) 및 혈청학적 검사는 널리 사용되는 비침습적 기술입니다. 이 중 UBT는 가장 방해가 되지 않고 가장 정확한 절차입니다. UBT는 H. pylori에 풍부하게 존재하는 요소분해효소를 사용하여 동위원소 표지된 요소를 암모니아와 이산화탄소(13C 또는 14C)로 가수분해합니다. 대조적으로, 면역크로마토그래피 분석법(ICA)⁷은 샘플링에 편리하고 간단하며 비침습적입니다. 그러나 테스트의 정확도는 대변 샘플의 품질, 온도, 샘플 수집과 테스트 사이의 간격과 같은 여러 요인의 영향을 받습니다. 면역 반응을 기반으로 한 또 다른 검사는 환자의 혈청에서 항체를 검출하는 혈청 H. pylori 항체 검사입니다. 그러나 이 검사는 박테리아가 제거된 후에도 항체가 오래 남아 있기 때문에 후처리 분석에는 적합하지 않다⁸. 또 다른 주요 단점은 이러한 방법이 H. pylori 감염만 진단하고 민감도 기반 치료를 안내하는 약물 내성 검사를 허용하지 않는다는 것입니다.

침습적 검사 방법의 경우 위 생검 조직을 내시경 검사로 채취한 후 조직학, 요소분해효소 신속 검사 및 세균 배양을 받아야 합니다. 이러한 테스트 방법은 여러 요인으로 인해 매우 제한적입니다. 현재 이러한 기술은 노인 환자, 전암성 또는 악성 질환의 고위험군, 위식도 역류 질환 또는 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 1차 치료에 실패한 환자로 제한되어 있다⁹. 둘째, H. pylori의 독특한 성장 특성으로 인해 박테리아 배양 성공률은 50%^{에 불과합니다.10}. 따라서 분자 검출 방법은 침습적 검출 방법의 높은 요구를 극복하고 민감도 기반 치료를 안내할 수 있는 새로운 희망을 제공합니다. 분자 검출 방법 중 정량적 PCR은 최근 몇 년 동안 엄청나게 발전했습니다. qPCR은 기존 PCR과 달리 겔 전기영동이 필요하지 않으며 어닐링 단계에서 프라이머와 프로브를 추가하여 샘플의 DNA/RNA를 정확하게 정량합니다. H. pylori 감염 및 약물 내성 검출을 위한 qPCR 키트는 현재 시판되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 각 방법에는 한계가 있습니다. 따라서 환자의 임상 진단 및 치료는 증상, 징후, 병력, 기타 실험실 검사 및 치료에 대한 반응과 함께 고려되어야 합니다.

현재 H.pylori 감염을 치료하는 주요 방법은 항생제를 복용하는 것이지만 최근에는 항생제 내성이 증가함에 따라 이러한 감염을 치료하는 것이 점점 어려워지고 있습니다. 그 결과, 헬리코박터 파일로리 치료 효능의 현저한 감소가 전 세계적으로 관찰되어 헬리코박터 파일로리 박멸이 주요 공중 보건 문제가 되었다¹¹.

클래리스로마이신과 레보플록사신은 H.pylori에 의한 감염을 치료하는 데 사용되는 두 가지 광범위한 항생제이지만 여러 연구에서 H.pylori 분리주에서 이 두 약물에 대한 광범위한 내성이 보고되었습니다 . A2143G, A2142G 및 A2142C는 마크로라이드가 결합하는 것을 방지하여 클래리스로마이신 내성을 유발하는 2.9kb 23S rRNA 유전자에서 발견되는 수많은 점 돌연변이 중 세 가지입니다. 동시에, 레보플록사신 내성 유전자의 돌연변이 유전자좌는 주로 gyrA 유전자¹²의 6개 돌연변이 부위(A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G)에 위치한다. 유전적 돌연변이를 기반으로 한 이러한 저항 메커니즘의 발견은 배양 기반 연구를 통해 H. pylori 의 검출을 분자 테스트로 점진적으로 전환했습니다.

전반적으로, H. pylori 감염 및 약물 내성을 검출하기 위한 비침습적이고 효과적이며 동시적인 진단 방법에 대한 긴급한 임상적 필요성이 있습니다. 우리는 샘플링의 어려움을 극복하고 다양한 프라이머 프로브를 사용하여 H. pylori 감염과 약물 내성을 동시에 검출한다는 목표를 달성하기 위해 결합된 스트링 테스트와 qPCR 방법을 채택했습니다.

본 연구는 중국 광저우 남부의과대학 광둥성 인민병원 윤리위원회에서 정한 윤리적 고려사항에 따라 수행되었다(승인번호: KY-Q-2022-384-02). 18-60세 연령대의 환자가 이 연구에 포함되었습니다. 검사 전 2주 이내에 항생제, 항균 한약, 양성자 펌프 억제제(PPI)와 같은 약물 또는_H2 수용체 길항제 등을 복용하는 환자는 본 연구에 포함되지 않았습니다. 지난 3개월 동안 H.pylori 치료를 받은 환자도 본 연구에서 제외되었습니다. 심각한 심장, 간, 신장 문제, 심각한 신경병증 또는 정신 질환이 있는 사람들도 이 연구에 참여할 수 없었습니다. 이 연구에는 임산부와 수유부가 포함되지 않았습니다. 이 연구에 사용된 소모품(시약, 화학 물질, 장비 및 소프트웨어)에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 위액 샘플링을 위한 스트링 테스트

1. 환자에게 샘플 수집 전에 밤새 금식하도록 요청하십시오.
2. 다음날 스트링 테스트 키트를 열고 캡슐을 가져간 다음 스트링 끝에서 루프를 잡습니다.
3. 끈을 환자의 뺨에 테이프로 붙이고 캡슐을 목구멍 뒤쪽 근처의 혀에 대고 물 한 모금과 함께 삼키도록 요청하십시오.
4. 캡슐이 환자의 위장에 용해되도록 하여 캡슐 내의 끈을 노출시켜 위 점액을 흡수합니다.
5. 환자가 캡슐을 삼킨 후 1시간 후에 숙련된 조수에게 끈을 조심스럽게 빼내도록 요청하십시오.
6. 위액에 담근 끈의 하단(40cm)을 잘라내어 TSE(Tris/saline/EDTA) s에 넣습니다.amp보존 용액, 그런 다음 상온(RT)에서 임상 실험실로 보내 H. pylori 의 후속 검출 및 qPCR을 사용한 항생제 내성 프로파일 측정.

2. DNA 추출

1. 시편을 운반하는 수집 튜브를 적절하게 라벨이 붙은 시험관 랙에 놓고 10초 동안 소용돌이칩니다.
2. 32웰 플레이트(핵산 추출 또는 정제 키트)를 여러 번 거꾸로 돌려 마그네틱 비드를 재현탁합니다. 10초 동안 짧은 소용돌이 후 플레이트에서 알루미늄 호일 밀봉을 조심스럽게 제거합니다.
3. 각 샘플에서 위액 200μL와 양성 대조군인 H. pylori DNA를 별도의 웰로 옮깁니다.
4. 자동 DNA 추출을 위해 핵산 추출기 기계의 해당 샘플 슬롯에 32웰 플레이트를 놓습니다.
5. DNA 추출 및 확인 후 양성 샘플에서 qPCR을 통해 클래리스로마이신 및 레보플록사신에 대한 항생제 내성 테스트를 시작합니다.
6. 과도한 위액과 추출된 DNA 샘플을 장기 보관 및 향후 사용을 위해 -20°C에 두십시오.
7. 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 이러한 모든 단계를 수행하십시오.

3. H. pylori 검출 및 항생제 내성(clarithromycin 및 levofloxacin)을 위한 qPCR

1. H. pylori 및 게놈에서 의심되는 항생제 내성 돌연변이를 검출하기 위해 qPCR을 수행합니다.
   1. qPCR 반응 혼합물(H. pylori 핵산 검출 키트)을 얼음 위에서 해동하고 시약의 손실을 방지하기 위해 플릭 및 스피닝으로 혼합합니다.
   2. 32웰 플레이트의 각 샘플에 대해 20μL의 PCR 반응 혼합물(유전자형 분석 반응 프리믹스[Taq 효소, 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산, 반응 완충액 및 염화마그네슘 포함]과 우 레아 정방향 및 역방향 프라이머 및 ureA 프로브)과 추출된 DNA 5μL를 혼합합니다.
   3. qPCR 기계에서 32웰 qPCR 플레이트를 실행합니다. 열 순환기 프로그래밍: 반응 혼합물은 먼저 42°C 및 95°C에서 각각 2분 동안 순차적으로 반응합니다(둘 다 한 사이클 동안). 이어서, 95°C에서 40사이클, 10초 동안 변성, 58°C에서 45초 동안 어닐링 및 연장한다.
   4. 형광 신호 획득을 FAM(H. pylori)으로 설정하고 데이터 획득을 증폭 연장 기간으로 설정합니다. 반응이 완료된 후 향후 결과 분석을 위해 데이터를 저장합니다.
   5. 기기가 자동으로 기준선 임계값을 선택하므로 qPCR용 특정 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
   6. H. pylori에 대한 테스트 결과가 양성이면 기계가 자동으로 샘플에 대한 약물 내성 테스트를 시작합니다. 시약 키트를 H. Pylori(qPCR) 키트의 23S rRNA 유전자 및 gyrA 유전자 돌연변이에 대한 검출 시약으로 교체합니다.
      참고: 시약 키트(헬리코박터 파일로리[qPCR]의 23S rRNA 유전자 및 gyrA 유전자 돌연변이에 대한 검출 시약)에는 PCR 반응 혼합물(유전형 분석 반응 프리믹스[Taq 효소, 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산, 반응 완충액, 염화마그네슘 포함], 프라이머 및 프로브)가 포함됩니다. 모든 부정적인 품질 관리 제품은 멸균 된 정제수입니다. H. pylori 핵산 검출 키트의 양성 품질 관리 제품은 비활성화된 H. pylori 표준 비드(ATCC 43504)입니다. 키트의 강력한 H. pylori 양성 및 약한 양성 품질 관리 제품(H. pylori의 23S rRNA 유전자 및 gyrA 유전자 돌연변이에 대한 검출 시약)은 표적 유전자와 돌연변이 유전자를 포함하는 비활성화된 H. pylori 균주의 DNA입니다. 마찬가지로 실제 상황에 따라 H. pylori 감염 또는 약물 내성의 존재를 포함한 모든 진단 표준은 CT ≤ 35로 설정되며 전형적인 S자형 곡선을 갖습니다. 약한 품질 관리의 농도는 1.0 x 10³ copies/mL인 반면 강한 품질 관리의 농도는 1.0 x 10⁸ copies/mL입니다.

qPCR에 의한 위액의 H. pylori 감염 및 항생제 내성 검출
우리는 ureA 유전자를 증폭하여 H. pylori 감염의 검출을 위해 qPCR을 수행하고 23S rRNA 유전자 및 gyrA 유전자의 점 돌연변이를 표적으로 하여 항생제 내성 프로파일을 결정했습니다(표 1). qPCR 실험의 세 그룹 모두에서 품질 관리 CT 값은 권장 범위 내에 있었으며, 이는 실험 당시 샘플이 모두 정상 상태였으며 테스트 결과가 신뢰할 수 있음을 나타냅니다. 이 연구에서는 실험 프로토콜의 신뢰성을 특성화하기 위해 테스트 결과가 다른 5개의 샘플(S1-S5)을 선택했습니다. S1은 감염이 없는 H. pylori의 대표적인 균주를 나타내는 반면, S2-S5 샘플은 H. pylori에 감염된 균주이며 내성 결과가 다릅니다(그림 1). H. pylori에 감염되지 않은 샘플에 대해 추가 저항 테스트를 수행하지 않도록 시스템을 설정했기 때문에 시스템 테스트에서 H. pylori에 대한 음성 결과가 나타난 후 S1 샘플이 저항 테스트에 들어가지 않았습니다. H. pylori 감염에 대해 양성인 샘플의 경우 S2 CT 값은 모두 검출 범위 내에 있었으며 이는 샘플이 H. pylori 양성이며 클래리스로마이신과 레보플록사신에 이중 내성을 보였으며 임상의는 재량에 따라 다른 치료 방법을 선택할 것을 권장했습니다. S3 CT 값은 H. pylori 감염 및 레보플록사신 내성 검사에 대한 검출 범위 내에 있는 반면, 클래리스로마이신 내성 검사에서는 CT 값이 검출되지 않았으며, 이는 S3 샘플이 레보플록사신 내성 환자에게서 나온 것임을 나타냅니다. 유사하게, S4 샘플의 CT 값은 H. pylori 감염 및 클래리스로마이신 내성에 대한 검출 범위 내에 있는 반면, 레보플록사신 내성에 대한 CT 값은 검출되지 않았으며, 이는 이 환자가 클래리스로마이신에 내성이 있음을 나타내며, 치료를 위해 레보플록사신을 복용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, S5 샘플 검사는 H. pylori 감염 검출에 대해서만 검출 범위 내의 CT 값을 보여 주었고, 이는 이 환자가 두 항생제 모두에 민감하고 두 약물 중 하나를 사용하여 치료할 수 있음을 나타냅니다. H. pylori 감염 및 약물 내성도 검출하는 세균 배양 방법에 비해 이 방법은 환자에게 손상을 주지 않고 H. pylori 감염 및 약물 내성을 검출하는 데 안전하고 효과적이며 의사가 적절한 치료 계획을 수립하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1: qPCR에 의한 위액에서 H. pylori 및 항생제 내성 검출.
(A) H. pylori 감염의 정량적 PCR 증폭, (B) 클래리스로마이신 내성 검출, (C) 레보플록사신 내성 검출. "S"는 샘플을 의미합니다. "S1"은 H. pylori 감염에 대해 음성으로 돌아온 샘플이며 항생제 내성 테스트도 받았습니다. "S2"는 클래리스로마이신과 레보플록사신 모두에 내성이 있는 H. pylori 감염 샘플입니다. "S3"는 또한 H. pylori 양성 샘플이지만 clarithromycin-감수성이 있고 levofloxacin-내성이 있습니다. "S4"는 또한 H. pylori 양성 샘플이지만 클래리스로마이신 내성 및 레보플록사신 감수성입니다. "S5"는 H. pylori 양성 샘플이지만 클래리스로마이신과 레보플록사신 모두에 취약합니다. 약한 품질 관리의 농도는 1.0 x 103 copies/mL인 반면 강한 품질 관리의 농도는 1.0 x 108 copies/mL입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: H. pylori 감염 및 클래리스로마이신 및 레보플록사신에 대한 내성의 검출에 대한 qPCR 결과를 보여주는 표. 이 표는 H. pylori 감염에 대한 정성적 결과, 분리주가 클래리스로마이신에 내성이 있음을 보여주는 23S rRNA 유전자 돌연변이의 검출 및 분리주가 레보플록사신에 내성이 있음을 보여주는 gyrA 유전자 돌연변이의 검출을 제시합니다. +/−, 정성적 결과; +, 긍정적 인 결과; -, 부정적인 결과.

없음.