방법 논문

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

DOI:

10.3791/65722

⸱

2024년 1월 12일

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 줄기 세포(MSC)는 주로 면역 반응을 조절할 수 있는 잠재력으로 인해 악화된 염증을 막기 위한 새로운 치료 접근법으로 광범위하게 연구되었습니다. MSC는 class I major histocompatibility complex(MHC) 분자의 낮은 발현과 동종 이식을 위한 세포 기반 요법의 사용을 기반으로 면역학적으로 호환되지 않는 동종 이식 수혜자에서 생존할 수 있는 면역 특권 세포입니다. 이 세포는 여러 조직에서 분리할 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 것은 골수와 지방 조직입니다. 당사는 마우스의 부고환 지방 조직에서 MSC를 분리, 배양 및 특성화할 수 있는 간편한 프로토콜을 제공합니다. 부고환 지방 조직은 외과적으로 절제하고 물리적으로 단편화한 후 0.15% 콜라겐분해효소 II형 용액으로 분해합니다. 그런 다음 1차 지방 조직 유래 줄기세포(ADSC)를 시험관에서 배양 및 증식하고 유세포 분석을 통해 표현형 특성 분석을 수행합니다. 또한 ADSC를 골형성(osteogenic), 지방형성(adipogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 세포로 분화하는 단계를 제공하고 각 세포 계통의 기능적 특성을 규명합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 in vivo 및 ex vivo 실험에 사용할 수 있으며, 대안으로 지방 유래 줄기 세포를 사용하여 MSC와 같은 불멸 세포를 생성할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 줄기 세포(MSC)는 조골세포, 연골아세포, 지방세포 1,2와 같은 세포로 분화하는 성체 다전위 세포입니다. 이 세포는 여러 장기에 존재하기 때문에 골수, 근육, 지방, 모낭, 치아 뿌리, 태반, 진피, 주위, 탯줄, 폐, 간 및 비장과 같은 성인 조직에서 추출할 수 있습니다 3,4.

MSC가 생리학 및 면역 체계에 미치는 영향은 5,6으로 보고되었습니다. 이 세포는 인간 및 수의학 모두에서 여러 질병을 치료하는 데 유망했습니다. MSC는 세포-세포 접촉, 용해성 인자 및 작은 세포외 소포체와 같은 다양한 메커니즘을 통해 염증을 제어하고 혈관 신생 및 조직 항상성을 촉진할 수 있습니다 7,8,9,10. 또한, MSC는 면역학적으로 양립할 수 없는 동종 이식 수혜자에서 생존할 수 있는 면역 특권 세포인데, 이는 이들 세포가 클래스 I 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 발현이 낮고 동종 이식을 위한 세포 기반 치료에 사용되기 때문입니다11,12. 낮은 면역원성과 재생 잠재력이 결합된 MSC는 이식편대숙주병(GvHD)13, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)14 및 다발성 경화증15 등과 같은 세포 치료에 이상적인 후보입니다16,17.

MSC가 여러 성인 조직에 존재한다는 사실에도 불구하고, 지방 조직은 최소한의 외과적 개입으로 수확에 대한 접근성과 같은 다른 공급원에 비해 이점을 제공합니다. 높은 팽창률을 가진 많은 수의 사용 가능한 셀; 특정 장비 및 저비용 재료 없이 수행하기 쉬운 프로토콜을 사용하여 체외 확장이 용이합니다 18,19,20. 추출한 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)는 국제 세포 치료 학회(International Society for Cellular Therapy, ISCT)에서 정한 대로 특성화해야 합니다21. 따라서 MSC는 엔도글린(CD105), 엑토-5'-뉴클레오티다아제(CD73) 및 Thy-1(CD90)과 같은 중간엽 마커의 높은 비율(≥95%)을 발현하고, 백혈구 공통 항원(CD45), 막관통 인산지방단백(CD34), 당지질 고정 막 당단백질(CD14), 인테그린 알파 M(CD11b), B세포 항원 수용체 복합체 관련 단백질 알파 사슬(CD79α)과 같은 조혈 마커의 낮은 비율(≤2%)을 발현하는 형태학을 보여야 합니다. B-림프구 표면 항원 B4(CD19) 및 클래스 II 인간 백혈구 항원(HLA-II). 또한, 기능적 특성화가 필요하며, 세포는 조골세포, 연골아세포 또는 지방아세포로 분화할 수 있어야 한다21.

여기에서는 in vitro 연구를 위한 기계적 해리 및 효소 소화를 사용하여 부고환 지방 조직에서 MSC를 얻는 방법과 ISTT에 의해 preconized 형태학적 특성 분석을 보여줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 동물 윤리에 대한 국제 지침에 따라 수행되었으며, 프로토콜 번호 021/22에 따라 산타 크루즈 주립 대학의 관리 및 사용 기관 위원회의 승인을 받았습니다. 스위스 수컷 마우스(6-8주)는 동물 사육, 유지 관리 및 실험 실험실 - 산타 크루즈 주립 대학(LaBIO-UESC) 동물 연구 시설에서 획득했으며, 특정 병원체가 없는 조건에서 유지되고 12시간 밝음/어두운 주기로 물과 음식을 즉시 받았습니다.

참고: 다른 마우스 계통을 사용할 수 있습니다. 성체 마우스(6-8주)는 증식 활성이 높은 지방 조직과 세포가 더 발달되어 있기 때문에 사용을 권장합니다.

1. 준비

알림: 계속하기 전에 아래에 설명된 다음 시약을 준비하십시오. 시약 및 재료 공급업체 정보는 재료 표를 참조하십시오. 마스크, 모자, 실험복, 장갑과 같은 개인 보호 장비는 모든 실제 절차에서 착용해야 합니다.

  1. 부고환 지방 조직 추출
    1. 수술 재료를 예약하십시오: 멸균 핀셋 및 가위 3세트, 바늘 5개, 70% 에탄올 200mL가 들어 있는 비커.
    2. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 혼합하여 말단 마취제를 준비합니다.
  2. ADSCs 문화
    1. 기초 배지: 10% 소 태아 혈청(FBS), 50μg/mL 겐타마이신, 0.25μg/mL 암포테리신 B, 100U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고포도당 배지를 준비합니다.
    2. 분해 용액 : 0.25 μm 필터에서 멸균 된 PBS에서 0.15 %의 콜라겐 분해 효소 II를 준비합니다.
      참고: 기초 배지에 설명된 4가지 항생제를 사용할 필요는 없습니다. 이것이 수행되는 실험실의 세포 배양 조건에 따라 다릅니다.
  3. ADSC 표현형 특성 분석
    1. PBS에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다.
    2. 항-마우스 항체를 표 1과 같이 희석한다.
    3. PBS에서 2% 포름알데히드를 준비합니다.
  4. ADSCs 골형성 분화
    1. 골형성 분화 배지: 5.67M 아스코르브산, 10nM 덱사메타손, 0.02M β-글리세로포스페이트, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 준비합니다.
    2. Von Kossa 염색을 위해 물에 70% 에탄올, 물에 5% 질산은, 증류수, 물에 5% 티오황산나트륨, 물에 1% 에오신 B를 준비합니다.
  5. 지방형성 분화:
    1. 지방 분화 배지: 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 200μM 인도메타신, 1μM 덱사메타손, 10μM 인슐린, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 준비합니다.
    2. 오일-레드 염색의 경우 탈이온수에 10% 포르말린, 탈이온수에 60% 이소프로판올, 60% 이소프로판올에 리소크롬(지용성 염료) 디아조 염료(오일-레드 O 용액), 탈이온수에 1% 헤마톡실린 용액을 준비합니다.
  6. 연골 형성 분화:
    1. 연골 형성 분화 배지: 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 연골 형성 배지를 준비합니다.
    2. PBS에서 10% 포름알데히드를 준비합니다.
    3. 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸 염색을 위해 다음 용액을 준비합니다: 아세트산의 헤테로글리칸 염색(Alcian Blue 1%), pH 2.5, 파라핀, 헤마톡실린, 에탄올 시리즈 희석(100%, 96%, 80% 및 70%).

항체/Fluorophore희석클론최종 농도(μg/mL)그것이 표현되는 기능과 세포
CD34- 체육1:100램342세포 접착 계수. 조혈모세포.
CD45- APC1:10030-F112백혈구 활성화를 돕습니다. 백혈구에서 발현됩니다.
CD71-피팅1:100다25세포 증식 중 철분 흡수를 조절합니다. 증식 세포, 망상 적혈구 및 전구 세포.
CD29-피팅1:100하2/55접착 및 활성화, 배아 발생, 백혈구, 수지상 세포, 혈소판, 비만 세포, 섬유 아세포 및 내피 세포.
CD90- 퍼CP1:100옥스-72신호, 접착력. T 림프구, NK, 단핵구, hemtopoietic stem cells, neuron 및 fibroblast.

표 1: 유세포분석기에 의한 ADSC의 표현형 특성 분석에 사용되는 항체. 각각의 형광 색소, 희석, 클론 및 최종 농도가 있는 항체 목록과 발현되는 세포에서의 기능.

2. 방법

참고: 지방 조직은 피하 또는 복강 내 위치에서 몸 전체에 분포되어 있습니다. 마우스에서 실험에 사용되는 가장 흔한 지방 조직에는 피하 부고환, 장간막 및 후복막이 포함됩니다22. 여기에서는 부고환 지방 조직을 얻는 단계를 보여줍니다(그림 1).

figure-protocol-1
그림 1: 스위스 쥐에서 지방 조직 유래 줄기 세포를 얻기 위한 실험 설계. (A) 바늘을 사용하여 동물을 코르크 또는 스티로폼 보드에 놓습니다. (B) 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고 복부 중앙을 절개하고 복막에서 피부를 분리합니다. (C) 부고환 위의 백색 지방 조직을 식별합니다. (D) 조직을 10% FBS 및 1% 항생제가 보충된 DMEM 배지로 옮기고, 부고환 지방 조직을 PBS로 철저히 세척하고, 조직을 소화 용액에 옮긴다. (E), 조직을 단편화하고 (F) 37 ° C에서 1 시간 동안 10 분마다 격렬하게 흔듭니다. (G) 세포를 계수한 후 6웰 플레이트에 플레이트를 넣고 도립 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. (F) 세포 형태는 원형에서 섬유아세포와 같이 변화합니다. 스케일 바 = 22.22 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 부고환 지방 조직의 적출
    참고: 모든 절차는 순수하고 오염되지 않은 세포 배양을 보장하기 위해 층류 캐비닛의 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
    1. 케타민과 자일라진 용액(100 및 10mg/kg, 단계 1.1.2에 설명된 대로)을 사용하여 동물을 복강 내 경로로 안락사시킵니다.
      참고: 다른 안락사 방법을 사용할 수 있습니다23. 심장 박동이 없는지 확인하여 동물이 죽었는지 확인하십시오.
    2. 알루미늄 호일로 덮인 코르크 또는 스티로폼 보드에 복부 쪽이 위로 향하도록 동물을 놓고 멸균 바늘을 사용하여 고정합니다(그림 1A).
      알림: 오염을 방지하려면 복부에 70% 알코올을 분사하십시오. 또는 메스로 머리를 면도하십시오.
    3. 복부 중앙의 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고 멸균 가위로 자릅니다.
      알림: 오염을 방지하기 위해 두 세트의 멸균 핀셋과 가위가 필요합니다. 첫 번째는 동물을 열고 피부와 복막층을 자르는 데 사용됩니다. 두 번째는 부고환 지방 조직을 집어 올리는 데 사용됩니다. 또한 비커에 70% 알코올 150mL를 남겨 두었다가 단계 사이에 가위와 핀셋을 청소합니다.
    4. 동물의 피부 아래에 가위를 넣고 열어 복막에서 분리합니다(그림 1B). 핀셋을 사용하여 복막층을 들어 올리고 멸균 가위로 자릅니다.
    5. 다른 멸균 핀셋과 가위를 사용하여 고환 위의 부고환과 부고환 위의 백색 지방 조직을 식별합니다. 약 2cm 크기의 멸균 핀셋을 사용하여 부고환 지방 조직 전체를 당기고 부고환에 매우 가깝게 자릅니다(그림 1C).
    6. 기초 배지가 들어 있는 50mL 멸균 원추형 튜브에 지방을 넣고 얼음 위에 놓습니다(그림 1D). 후드에서 아래 설명된 대로 다음 단계로 진행합니다.
  2. 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC) 분리
    참고: 생물학적 클래스 II 층류 후드에서 샘플을 처리하고 직원은 실험실 가운, 장갑 및 수술용 마스크를 착용해야 합니다.
    1. 부고환 지방 조직을 PBS로 철저히 세척합니다.
      참고: 이 단계는 샘플에서 혈액 및 기타 입자를 제거하는 데 필수적입니다. 혈액은 콜라겐분해효소 II형 효소를 억제하고 실험을 손상시킬 수 있습니다.
    2. 멸균 핀셋을 사용하여 부고환 지방 조직을 15-20mL의 분해 용액이 들어 있는 50mL 튜브에 1.2.2.2단계로 준비합니다. 멸균 가위를 사용하여 조직을 조각화하고 37°C에서 1시간 동안 조직을 배양합니다(그림 1E, F).
      알림: 이 단계에서는 37°C의 수조 또는 인큐베이터를 사용할 수 있습니다. 10분마다 소화를 용이하게 하기 위해 현탁액을 세게 흔들어야 합니다. 1시간 배양 시간을 연장하지 마십시오.
    3. 샘플을 기저 배지에서 1:1로 희석하여 콜라겐분해효소를 비활성화하고 현탁액을 250 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 기질의 혈관 분획을 얻습니다. 상층액을 버리고 펠릿을 1mL의 기초 배지에 재현탁시킵니다.
    4. 1:10 또는 1:100의 희석을 사용하여 Neubauer 챔버에서 트리판 블루 염료 배제 방법을 통해 생존력을 확인하고 세포를 계수합니다.
      참고: 예상 수율은 약 0.5-100만 cells/g의 처리된 지방 조직이며 생존율은 80%입니다.
    5. 분리된 세포(0.3-0.5백만)를 6-웰 플레이트의 한 웰에 있는 3mL의 기초 배지에 플레이트합니다. 5 % CO 2 로 37 ° C에서 밤새 세포를 배양합니다.
    6. 다음 날: 우물에서 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척합니다. 기초 배지 3mL를 추가합니다. 세포가 90% 합류할 때까지 2일마다 이 과정을 반복합니다.
      참고: 도립 현미경으로 세포의 형태가 원형에서 섬유아세포와 같이 변하는 것을 항상 관찰하십시오(그림 1H).
  3. 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC) 증식
    참고: 세포가 ~90% 합류하여 성장하면 아래 설명된 대로 하위 배양을 진행합니다.
    1. 웰에서 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척합니다. 0.5mL/웰의 트립신/EDTA(0.05% 트립신; 200mg/L EDTA)를 추가하고 37°C에서 3-5분 동안 플레이트를 배양하여 세포를 분리합니다.
      참고: 트립신/EDTA에서 5분을 초과하지 마십시오. 세포의 완전한 분리는 도립 현미경으로 확인해야 합니다. 이 과정은 조심스럽게 위아래로 피펫팅하거나 플레이트의 측면을 두드려 가속화할 수 있습니다.
    2. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제가 보충된 DMEM에서 샘플을 1:1로 희석하여 효소를 비활성화합니다.
    3. 세포 현탁액을 2개의 웰로 분할하고 3mL의 기초 배지(10% FBS 및 1% 항생제로 보충된 DMEM)를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 밤새 배양합니다.
    4. 다음날 배지를 교체한 다음 90%가 합류할 때까지 2일마다 교체합니다.
    5. 세 번째 단락까지 이 과정을 반복하고 표현형 및 기능적 특성화를 진행합니다.
      참고: 항상 도립 현미경으로 세포의 형태를 관찰하여 원형에서 섬유아세포와 같이 변하는 것을 관찰하십시오.
  4. 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC) 특성 분석
    1. 유세포 분석에 의한 표현형 특성 분석
      1. 2.3.1 - 2.3.2단계에 설명된 대로 Trypsin/EDTA를 사용하여 셀을 분리합니다.
      2. 원뿔형 튜브(50mL)에 세포를 수집하고 4°C에서 10분 동안 250 x g 으로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁시킵니다.
      3. 2.2.4 단계에서 설명한대로 세포를 세고 96 웰 플레이트에서 100 μL의 PBS에 0.5-1 x 106 세포를 파종합니다.
        NOTE: well의 수는 fluorochrome conjugate의 색상과 유세포의 filters/lasers에 따라 달라집니다.
      4. PBS에 1% BSA에 희석된 항체(표 1)를 추가합니다.
        참고: 우리는 이미 BSA를 사용하여 항체를 희석하기 때문에 비특이적 결합을 피하기 위해 Fc 블록을 사용할 필요가 없습니다. 염색 제어제로 사용될 항체를 받지 않고 세포 샘플을 예약합니다. 항체는 실험실에서 사용할 수 있는 형광 색소 염료 및 유세포계에 따라 동일한 웰에서 결합할 수 있습니다. 표 1 에 기술된 모든 항체는 동일한 웰에 첨가될 수 있지만, CD71 FITC 및 CD29 FITC는 예외이며, 이들은 동일한 형광 색소로 인해 다른 웰에 있어야 한다.
      5. 어두운 곳에서 4 ° C에서 30 분 동안 플레이트를 배양합니다.
      6. 세포를 세척한 다음 PBS를 사용하여 부피를 200μL로 완료하고 플레이트를 252 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
      7. PBS에서 2% 포름알데히드의 웰당 200μL를 추가하여 세포를 고정합니다. 유세포분석기에서 분석할 때까지 4°C의 어두운 곳에 세포를 보관합니다.
        참고: 최상의 결과를 얻으려면 가능한 한 빨리 유세포 분석기에서 세포를 획득하십시오. 마커의 형광 밝기는 대부분의 형광 색소에서 48시간 후에 크게 감소합니다. 따라서 플레이트를 읽는 데 48시간을 초과하지 마십시오. 30,000개의 이벤트를 획득하는 것이 좋습니다.
      8. 그림 2B에 제시된 게이팅 전략을 사용하여 ASC 모집단을 선택합니다.
    2. 기능적 특성화: 골형성 분화(Osteogenic differentiation)
      1. Trypsin/EDTA를 사용하여 세포를 분리하고(2.3.1 - 2.3.2단계 참조) 세포를 수집 및 원심분리하고(2.4.1.2 및 2.4.1.2단계 참조) 세포를 계산합니다(2.2.4단계 참조).
      2. 플레이트, 삼중, 기저 내측의 6-웰 플레이트에서 웰당 2 x 105 세포(10% FBS 및 1% 항생제로 보충된 DMEM); 37 ° C에서 5 % CO 2 로 배양합니다.
        참고: 각 분화 시간(14일 및 21일)에 하나씩 두 개의 6웰 플레이트가 필요합니다.
      3. 다음 날, 배지를 골형성 배지로 변경합니다(단계 1.4.1).
        참고: 분화를 위한 제어가 될 기초 배지로만 배양되는 3개의 웰을 예약하십시오.
      4. 골형성 배지와 대조 세포에서 14일 및 21일 동안 세포를 배양하고 3일마다 배지를 교체합니다. Von Kossa 염색(단계 1.4.2)으로 진행하여 각 배양 기간이 끝날 때 광물화된 결절을 평가합니다.
      5. 각 웰에서 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 실온(RT)에서 하룻밤 동안 70% 에탄올 2mL로 셀을 고정합니다. 흐르는 물에 세포를 조심스럽게 씻으십시오.
      6. 5% 질산은 용액 2mL를 넣고 플레이트를 자외선에 1시간 동안 배양합니다. 증류수로 세포를 씻으십시오. 5% 티오황산나트륨 2mL를 넣고 5분 동안 배양합니다. 증류수로 씻으십시오.
      7. 40초 동안 2mL의 에오신으로 대조염색합니다. 염색 용액이 제거될 때까지 증류수로 세척하고 광학 현미경을 사용하여 염색을 시각화합니다.
    3. 기능적 특성화: 지방형성 분화(Adipogenic differentiation)
      1. Trypsin/EDTA를 사용하여 세포를 분리하고(2.3.1 - 2.3.2단계 참조) 세포를 수집 및 원심분리하고(2.4.1.2 및 2.4.1.2단계 참조) 세포를 계산합니다(2.2.4단계 참조).
      2. 플레이트 2 x 10 기저 내측의 6-웰 플레이트에서 웰당5 개 세포(10% FBS 및 1% 항생제로 보충된 DMEM); 37 ° C에서 5 % CO 2 로 배양합니다.
        참고: 각 분화 시간(14일 및 21일)에 하나씩 두 개의 6웰 플레이트가 필요합니다.
      3. 다음 날 배지를 지방 생성 배지로 변경합니다(2.5.1단계).
        참고: 기저 배지를 대조군으로만 배양하는 3개의 웰을 예약하십시오.
      4. 지방 형성 배지에서 14일 및 21일 동안 세포를 배양하고 3일마다 배지를 교체합니다. 각 배양 기간이 끝나면 세포 내 지질 축적의 지표인 Oil-Red O 염색(단계 2.4.3.5-2.4.3.7)으로 진행합니다.
      5. 각 웰에서 미디어를 흡입합니다. PBS로 세포를 두 번 씻습니다. 10% 포르말린 2mL에 세포를 1시간 동안 고정합니다. PBS로 한 번 씻은 다음 물로 한 번 씻으십시오.
      6. 60% 이소프로판올에 2mL의 Oil-Red O 용액을 넣고 5분 동안 염색합니다. 증류수로 한 번 씻으십시오.
      7. 증류수에 1:2로 희석한 1% 헤마톡실린 2mL로 1분 동안 대조염색합니다. 염색 용액이 제거될 때까지 증류수로 세척하고 광학 현미경을 사용하여 염색된 샘플을 시각화합니다.
    4. 기능적 특성화: 연골 형성 분화(Chondrogenic differentiation)
      1. Trypsin/EDTA를 사용하여 세포를 분리하고(2.3.1 - 2.3.2단계 참조) 세포를 수집 및 원심분리하고(2.4.1.2 및 2.4.1.2단계 참조) 세포를 계산합니다(2.2.4단계 참조).
      2. 4개의 폴리프로필렌 원추형 튜브에 5 x 105 ADSC를 넣고 450 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 상층액을 버립니다.
      3. 콘드로겐 배지 (단계 1.6.1) 또는 기저 배지 (분화 제어)에서 원뿔형 튜브의 펠릿을 37 ° C에서 14 일 및 21 일 동안 5 % CO2 로 배양합니다. 3일마다 매체를 교체하고 펠릿을 제거하지 마십시오.
        참고: 각 세포 펠릿은 각 배양 시간과 기초 배지로만 성장한 각각의 대조군을 나타냅니다.
      4. 각 배양 시점이 끝나면 끝이 가는 핀셋을 사용하여 펠릿을 수집하고 24웰 플레이트에 넣습니다. 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸의 조직학적 절편 및 염색을 진행합니다(단계 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        알림: 각 펠릿은 별도의 웰에서 처리됩니다.
      5. 2% 완충된 포름알데히드 2mL에 펠릿을 30분 동안 고정합니다. 포름알데히드 용액을 버리고 70% 에탄올 2mL를 추가합니다. 팁을 사용하여 원추형 튜브에서 펠릿을 제거하고 펠릿을 파라핀에 삽입합니다.
      6. 회전하는 파라핀 마이크로톰을 사용하여 5μm의 조직학적 절편을 만듭니다. 60 ° C에서 15 분 동안 절편을 배양하고 크실렌에 두 번 담급니다 (5 분 및 15 분 동안).
      7. 조직학적 절편을 각각 2분 동안 감소하는 농도(100%, 96%, 80% 및 70%)의 알코올 수조에 담가 샘플을 재수화한 다음 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다.
      8. 아세트산, pH 2.5에 Alcian blue 1%로 샘플을 30분 동안 염색합니다.
      9. 헤마톡실린으로 1분 동안 염색하고 증류수로 세척합니다. DPX(mountant for histology) 또는 기타 마운트 용액으로 마운트하고 광학 현미경을 사용하여 샘플을 시각화합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 프로토콜에 따라 지방 조직에서 추출한 세포는 ISCT에서 제안한 MSC에 대한 최소 기준과 일치하는 형태를 보여주었습니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 표현형적으로, ADSC는 세포 배양 초기에 플라스틱 및 섬유아세포와 유사한 형태에 대한 부착을 보여주었습니다(그림 2A). 게다가, 그들은 균질하게 성장하여 식민지를 형성했습니다. 또한, ADSC는 조혈 마커인 CD34(2.12%)와 CD45(1.81%)의 발현이 낮았고, 모든 중간엽 세포 마커인 CD71(42.6%), CD29(74.2%), CD90(55.1%)의 발현이 높았다(그림 2B).

figure-results-1
그림 2: 지방 조직 유래 세포의 표현형 특성 분석. (A) 배양 2일, 4일, 8일째에 원형에서 섬유아세포와 유사한 형태로 변하는 ADSC 형태; 스케일 바 = 22.22 μm. (B) ASC에 의해 표현되거나(CD71, CD29 및 CD90) 표현되지 않는(CD34 및 CD45) 마커에 대한 히스토그램. 이 그림은 Miranda et al.24의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기능적으로, ADSC는 14일 또는 21일 동안 각 계통에 대해 조건화된 배지에서 배양했을 때 조골세포, 지방아세포 및 연골아세포로 분화할 수 있는 다능성을 보여주었습니다(그림 3). Von Kossa 염색은 골형성 과정의 특징인 세포외 기질에서 광물화된 결절을 드러냈습니다(그림 3). Oil-red O 염색은 ADSC의 세포질에서 지질 액포를 입증했으며, Alcian Blue 염색은 세포외 기질에 글리코사미노글리칸의 존재를 확인했습니다(그림 3). 표현형 및 기능적 특성은 부고환 지방 조직에서 추출한 세포의 집단을 MSC로 확인했습니다.

figure-results-2
그림 3: 지방 조직 유래 세포의 기능적 특성 분석. 배양 14일 및 21일 후 ADSC의 골형성, 지방형성 및 연골형성 다계통 잠재력. 스케일 바 = 50 μm (상단 패널), 100 μm (중간 및 하단 패널). 이 그림은 Miranda et al.24의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC는 다양한 조직에서 추출할 수 있습니다. 골수가 쥐와 인간 모두에서 MSCs의 공통 공급원을 나타내고 있음에도 불구하고25,26, 우리는 MSC가 풍부하고 신체에 분포하며 접근이 용이하기 때문에 이 연구에서 지방 조직과 함께 작업하기로 결정했습니다. 대안으로, 지방 유래 줄기 세포를 사용하여 MSC와 같은 불멸화 세포를 생성할 수있다 27.

추출의 일부 포인트는 여기에 공유된 프로토콜의 성공을 위해 특별한 주의를 기울일 가치가 있습니다. 먼저, 무균 상태에서 수행해야 하는 조직 채취에 대한 주의를 강조합니다. 따라서 수술을 시작하기 전에 쥐를 70% 알코올로 적절하게 소독했는지 확인하십시오. 또 다른 중요한 점은 동일한 핀셋과 가위를 사용하여 부고환 지방 조직을 집어내지 않도록 하여 오염원을 피하는 것입니다.

두 번째 관심사는 조직 처리입니다. 원추형 튜브의 조각은 37°C에서 10분 동안 배양하여 적절하고 세게 흔들어야 합니다. 다음 날과 2-3일마다 매체를 교체하는 것이 매우 중요합니다. 매일 배양을 관찰하고 배지 색상, 세포 모양 및 배양 환경의 간섭을 확인하는 것이 좋습니다.

세 번째 우려 사항은 MSC 특성화를 위한 최적의 시간/경과에 관한 것입니다. 여기에서는 세포의 세 번째 통로에서 수행하는 것이 좋지만 필수는 아닙니다. 연구의 목적에 따라 다릅니다. 세 번째 단락에서는 MSC로 특성화된 세포의 약 80%를 가지고 있으며, 이는 예를 들어 이 연구의 목표에 충분합니다. 표현형 특성 분석은 조혈 마커(예: CD34 및 CD45) 및 중간엽 마커(예: CD29, CD73, CD90 및 CD105)의 발현을 분석하여 수행됩니다. 또한, 국제세포유전자치료학회(International Society for Cell and Gene Therapy, ISCT)21 는 ADSC가 섬유아세포와 유사한 형태를 가져야 하며 배양 플랫폼의 플라스틱에 부착되어야 한다고 강조합니다. 형태는 성장하는 배양 중에 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 기능적 특성 분석은 ADSC가 조골세포, 지방아세포 및 연골아세포 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 분석하여 수행됩니다. 표현형 특성 분석에서 중간엽 및 조혈 마커의 비율은 동물 종 및 세포 공급원에 따라 달라질 수 있으며, ISCT에서 권장하는 수치를 완전히 충족하지 못할 수 있습니다. 예를 들어, ISCT는 인간 MSC의 경우 CD105, CD73, CD90의 ≥95%, CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79a 또는 CD19의 ≤2%를 인간 백혈구 항원 - DR 동형(HLA-DR)21을 권장합니다. 또한, 기능적 특성 분석을 수행하고 조골세포, 연골세포 및 지방세포 계통으로 분화하는 세포의 다능성을 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 계통 중 적어도 두 개는 다능성을 증명하기 위해 권장됩니다.

이러한 강조된 사항 외에도 여기에서 제안하는 일부 분석법(예: Von Kossa 염색 대신 Alizarin Red S, Alcian Blue 대신 Periodic Acid Shiff, 유세포 분석 대신 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 대체할 수 있습니다.

인체에서 나타나는 세 가지 유형의 지방 조직(백색, 갈색, 베이지색) 중에서 백색 지방 조직은 MSCs의 공급원이 가장 높다28. 이 조직은 여기에 보고된 부고환 위의 지방과 같은 피하, 복부 및 서혜부 영역에서 얻을 수 있습니다. 여기에 공유된 프로토콜에 사용된 콜라겐분해효소에 의한 물리적 단편화 및 효소 소화는 처리 중에 고갈되는 지방세포를 제외한 많은 세포 유형으로 구성된 기질 혈관 분획(SVF)을 유도합니다.

결론적으로, MSC의 공급원으로 지방 조직을 사용하는 주요 이점은 항염증 및 재생 특성으로서의 MSC의 치료 잠재력과 관련된 세포 분리 방법의 풍부함과 용이성을 포함합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) 및 Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11)의 보조금으로 지원되는 연구. 이 연구는 PROPP UESC(073.6764.2019.0021079-85)의 일부 재정 지원을 받았습니다. MGAG와 URS는 각각 FAPESB(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia)와 CAPES(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)에서 수여하는 장학금 덕분입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
140 > C 고온 살균 CO2 인큐베이터RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, 중국C180
3-이소부틸-1-메틸크산틴시그마-알드리치, 샌루이스, 미주리, 미국I7018
아세트산 빙하시그마-알드리치, 샌루이스, 미주리, 미국PHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, 당단백질 검출에 적합합니다. 아세트산 1%, pH 2.5
알코올 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% 물
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
항체와 관련상품 anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005세포의 기능: 접착 및 활성화, 배아 형성, 백혈구, DC, 혈소판, 비만 세포, 섬유아세포 및 내피 세포
항체 항-마우스 anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387내 기능: 세포 접착 인자. 조혈 줄기 세포
항체 항체 anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864내 기능: 백혈구 활성화 지원
항체 anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266내 기능: 세포 증식 중 철 흡수를 조절합니다. 증식 세포, 망상 적혈구 및 전구체
항체 anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266세포의 기능: 신호전달, 접착. T 림프구, NK, 단핵구, HSC, 뉴런, 섬유아세포
아스코르브산Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, 미국A7906
세포 배양 플레이트 (6-well)Merck, 다름슈타트, 독일Z70775907 단위 멸균. TPP 조직 배양
플레이트세포 배양 플레이트(96-well. 원형 또는 V 하단)Merck, 다름슈타트, 독일CLS35307701 유닛 멸균. Wells, 96, Tissue Culture (TC) 처리된 표면, 둥근 바닥 투명 웰, 멸균
연골 생성 매체Stem Pro Chondrogenesis Differentiation– 생명 기술A1007101TGF-β 2, TGF-&베타; 3, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, ITS, 나트륨-L - 아스코르브산염, 피루브산나트륨, 아스코르브산-2-인산
분해효소 II형 콜라겐분해효소 유형 IILife Technologies, 캘리포니아, 미국17101015
알루미늄으로 덮인 코르크 또는 스티로폼 보드해당 없음1단위
없음50g
덱사메타손Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
해부 가위해당03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD55231000 mg/L 포도당 및 L-글루타민, 중탄산나트륨 없음, 분말, 세포 배양에 적합
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
포름알데히드Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
피하 주사 바늘 (0.3mm x 13mm)해당 없음5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, 미국 미주리I0200000
인슐린시그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국I3536
이소프로판올시그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국563935H2O
케타민-D4 염산염 용액그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국K-0061.0 mg/mL 메탄올(유리 염기), 인증 참조 물질, Cerilliant®
Neubauer 챔버Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620브랜드 카운팅 챔버 BLAUBRAND Neubauer 패턴. 클립, 이중 괘
Nichiryo 피펫 팁(0.1– 10 &뮤; L)Merck, 다름슈타트, 독일Z645540볼륨 범위 0.1– 10 &뮤; L, 길쭉한, 벌크 팩. 멸균
Nichiryo 피펫 팁 (1– 10 mL)Merck, 다름슈타트, 독일Z717401부피 범위 1– 10 mL, 범용, 벌크 팩. 멸균
Nichiryo 피펫 팁 (200 μ L)Merck, 다름슈타트, 독일Z645516최대 볼륨 200 μ L, 졸업, 미니 스택. 멸균
오일-레드 O 용액Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146– 48, 블록 형태
페니실린/스트렙토마이신시그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국P4333용액 안정화, 10,000 단위 페니실린 및 10 mg 스트렙토마이신/mL, 0.1 μ m 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합
인산염 완충 식염수 1x(PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813분말, pH 7.4, 1L 용액 준비용. 균형 잡힌 멸균
폴리프로필렌 코니컬 튜브(15mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53A멸균
폴리프로필렌 코니컬 튜브(50mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-22멸균
메스 2개(선택 사항)해당 없음1개
질산은Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
소듐 티오설페이트Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
수술용 핀셋 (15 cm)적용되지3 유닛 멸균
스위스 남성 마우스 (6– 8주)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
주사기(1mL)해당 없음1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합
트립신/EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-글리세로인산이 나트륨 염 수화물Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, 세포 배양에 적합, 식물 세포 배양에 적합, ≥ 99%(적정)
세포 세포 세포 면 해당 없음 중 70% 시 않음

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Stem Cell IsolationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationAdipogenic DifferentiationChondrogenic DifferentiationCollagenase DigestionMouse Epididymal Tissue

관련 논문