여기에서는 Trypanosoma evansi에 감염된 마우스의 통각을 평가하기 위한 프로토콜을 제시하며, 전자 von Frey 장치를 도구로 사용하여 뒷발과 내장의 기계적 역치를 측정합니다.
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방법 논문
Trypanosoma evansi-Infected Mice의 Allodynia 및 통증을 평가하기 위해 Mouse Grimace Scale과 관련된 Electronic von Frey
이 논문에서
요약
초록
감염성 질환 발병기전은 여전히 연구해야 할 복잡한 분야입니다. 이질증 및 통증과 같은 여러 임상 징후의 경과가 가축에서 관찰 될 수 있습니다. 그러나 그들의 경로와 올바른 치료에 대한 지식은 통제된 실험을 필요로 하며, 그 중 많은 부분이 실험실 동물을 사용합니다. 뒷발과 내장의 기계적 역치 변화를 측정하는 것은 설치류의 통증 인식 변화를 관찰하는 데 유용한 기술입니다. 철수 반응은 기준선 테스트에서 먼저 측정할 수 있으며, 이는 실험 그룹을 더 잘 제어할 수 있도록 합니다. 감염을 유도하고 프로토콜에 약물을 추가한 후 후속 검사를 수행할 수 있습니다. 통증과 같은 변화를 관찰하기 위해 안면 척도 사용과 관련된 전자 von Frey 장치를 사용하면 마우스의 이질증 및 통증을 평가하기 위한 간단하고 정확하며 일관된 평가가 가능합니다. 따라서, 트리파노소마 에반시 감염에 대한 본 방법론을 사용한 실험은 실험실 감염 동물에서 이질증 및 통증을 평가하는 유용한 방법을 나타내며, 이는 가축 동물에 대한 기존 치료에 적용될 수 있다.
서론
트리파노소마 에반시(Trypanosoma evansi)는 남아메리카에서 "수라(surra)" 또는 "말-다스-카데이라스(mal-das-cadeiras)"라고 불리는 질병의 원인이다 1,2. 이 병은 일반적으로 말과 소에 영향을 미치지만, 야생 동물군에도 영향을 미치며, 혈구박쥐, 타바니드, 기공파리에 의해 전염된다 1,3. Surra는 가축의 주요 질병으로 올바른 치료가 없을 경우 치명적일 수 있으며 빈혈, 식욕 및 체중 감소, 근육 약화 및 유산과 같은 비특이적 임상 징후를 나타낼 수 있으며 이는 숙주 및 지리적 지역에 따라 다를 수 있습니다 2,4,5,6.
질병이 진행되는 동안 감염된 동물에서 이질증과 통증의 발현은 여전히 새로운 주제입니다 2,7. 이러한 징후 뒤에 있는 발병 기전을 이해하려는 욕구는 고전적인 트리파노시달 프로토콜 5,6에 효과적인 진통제를 추가함으로써 현재 사용되는 치료법을 개선하고 정제하기 위한 중요한 단계입니다. 이 시나리오에서는 쥐를 실험실의 통제된 환경에서 쉽게 보관할 수 있으므로 가축을 사용한 현장 실험보다 더 일관된 결과를 얻을 수 있기 때문에 쥐 모델을 사용하여 질병을 복제할 수 있는 가능성이 있습니다.
기계적 임계값은 일반적으로 방대한 수의 실험에서 이질체를 평가하기 위해 전자 폰 프레이(EvF) 장치를 사용하여 얻어집니다 2,8,9. 이 장치는 기계적 자극에 대한 조직의 민감도를 평가하는 데 사용됩니다 : 장치가 장치에 부착 된 20-200 μL 팁을 통해 동물의 발에 닿으면 동물이 발을 빼내는 힘이 기록됩니다.
설치류는 일반적으로 이러한 실험에서 표준 동물로 사용되며, 대부분의 연구 된 질병은 통제 된 연구를 수행하기 어려운 다른 종에서 유래하기 때문에 대부분의 결과는 다른 종으로 외삽됩니다. 더욱이, 이질증과 통증은 밀접하게 관련되어 있다. 감염된 마우스의 통증을 평가하기 위해 특정 안면 척도를 사용하는 것은 T. evansi 감염 과정 동안 통증의 존재를 확인하기 위한 확인 보조제로서 중요한 역할을 합니다 2,10.
이 프로토콜에서는 T. evansi에 실험적으로 감염된 마우스의 이질증과 통증을 평가하기 위한 새로운 모델을 보여주며, 변수 간에 높은 상관관계를 보여 강력한 모델임을 입증했습니다. 또한 전체 절차를 수행하는 데 소수의 연구원이 필요하므로 실험 중 사람의 간섭 가능성이 줄어듭니다. 또한 연구자가 급성 과정 동안 표적 질환을 복제하고 실험 설계에 여러 가지 다른 치료 약물을 추가하여 단기간에 일관된 결과를 얻을 수 있습니다.
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프로토콜
모든 실험은 10주 된 성인 암컷 스위스 마우스(35-55g)를 사용하여 수행되었습니다. 동물들은 온도 조절(21 ± 1 °C), 12시간 빛/12시간 어두운 주기, 표준 실험실 차우 및 물 광고 리비텀이 있는 방에서 폴리설폰 케이지(케이지당 3-5마리)에 수용되었습니다. 약물 치료의 일관된 효과를 입증하기 위해 모든 테스트에서 각 그룹에 10마리의 동물을 할당했습니다. 실험 설계는 Santa Catarina State University(CEUA) 윤리 위원회(프로토콜 번호: 6019201123)에 의해 제출되고 승인되었습니다. 모든 동물실험은 ARRIVE(Animal Research: Reporting of in vivo Experiments)를 준수하였으며, 국가연구위원회(National Research Council)의 '실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침'에 따라 수행되었다.
1. 트리파노소마 에반스 준비 및 접종
주의: 감염된 혈액 샘플, 시약 및 기타 화학 화합물을 다룰 때는 일회용 실험실 가운, 장갑, 마스크 및 보안경을 착용하십시오.
- 수조 장비를 켜고 37°C의 일정한 온도에서 조정하십시오.
- 보존된 혈액이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 꺼냅니다.amp초냉동고(-80°C)에서 꺼냅니다. 피가 녹을 때까지 수조에 넣으십시오.
참고: 동일한 수의 혈액 통로를 유지하기 위해 서로 다른 실험의 모든 그룹에서 모든 마우스를 감염시키는 데 동일한 분리체를 사용해야 합니다. - 60% D-(+)-포도당(pH 7.4)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS, 0.1M)를 사용하여 0.1mL당 1 × 104 개의 트리파노솜이 달성될 때까지 연속 희석(10:1 v v)을 수행합니다. 100x 대물 렌즈가 있는 현미경의 Neubauer 챔버를 사용하여 수동 세포 계수로 기생충 세포의 수를 결정합니다2.
- 인슐린 주사기에 연결된 26G 1/2" 바늘을 사용하여 0.9% 식염수(대조군) 또는 0.9% 식염수(대조군)에 동일한 부피의 혈액 용액을 접종합니다.
2. Electronic von Frey 장치 설정 및 작동
알림: 획득한 데이터가 기록되는 방식에 주의하십시오. 일부 EvF 장비에는 장치에서 얻은 데이터를 컴퓨터, 태블릿 또는 스마트폰과 같은 다른 전자 장치로 전송하기 위한 특정 프로그램이 있습니다.
- EvF 장치를 켭니다. 실험을 시작하기 전에 장비가 잘 충전되어 있는지 확인하고 장비 화면에 표시된 배터리 잔량을 관찰하고 필요한 경우 충전하십시오.
- Wi-Fi를 통해 EvF 장치를 선택한 전자 장치에 연결하여 얻은 데이터를 전송하고 저장합니다.
- 10μL 폴리프로필렌 팁을 EvF 장치 콘에 삽입하고 발 기호가 있는 버튼을 눌러 판독값을 0(0.00g)으로 설정합니다.
- 평가된 조직이 조사되면 관찰하십시오. 최대 적용 압력은 EvF 장치 디스플레이에 표시됩니다. 그런 다음 안전한 녹화를 위해 안테나 기호가 있는 버튼을 눌러 선택한 전자 장치로 전송하십시오.
- 판독값을 0으로 재설정하고 발 기호가 있는 버튼을 다시 누르기만 하면 새 측정을 할 수 있습니다.
3. 기계적 임계값 평가에 대한 일반적인 고려 사항
- 모든 실험은 21°C로 온도가 조절되고 12시간 밝음/12시간 어둡게 주기가 있는 조용한 방에서 수행하고, 하루중 2 시간에 모든 평가를 수행하여 쥐의 생체 주기를 준수해야 합니다.
- 동일한 사람이 기준선 및 실험적 기계적 임계값 평가를 모두 수행하여 편향을 줄이고 측정 일관성을 보장하도록 합니다. 실험이 블라인드 처리되었는지 확인합니다.
- 5mm² 메쉬 플로어 스탠드 2,8에 천공된 상단이 있는 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)로 만든 개별 챔버 내부에 각 마우스를 부드럽게 놓습니다.
- 기준선 및 실험적 기계적 임계값을 모두 평가하기 전에 마우스가 PMMA 챔버에서 30분 동안 적응하도록 합니다2.
- 메쉬 바닥 스탠드를 편안한 높이(안정된 표면 위)에 놓아 동물이 모든 면에서 접근할 수 있도록 합니다. 쥐의 복부와 네 발 모두가 메쉬 바닥 개구부를 통해 쉽게 접근할 수 있는지 확인하십시오.
- 배뇨 및 배변을 흡수하거나 수집하기 위해 흡수성 물질로 챔버를 할당하는 데 사용되는 안정된 표면을 덮습니다. EvF 장치를 작동하는 동안 조사관의 팔이 챔버 아래로 자유롭게 움직일 수 있는지 확인하십시오.
4. 기준선 기계적 역치 평가 및 자극에 대한 마우스 반응
- 복부 측정의 경우 복부를 세 개의 가상 부분(두개골, 중간 및 꼬리 영역)으로 나눕니다. 두개골 영역(해부학적으로 간을 포함)을 내장 이질증 기계적 역치 평가를 위한 표준 표적 조직으로 선택합니다. 발 측정의 경우 표준화를 위해 올바른 뒷발을 선택하십시오.
- 감염 48시간 전에 각 마우스에서 기준선 측정을 수행합니다. 그렇게 하려면, 마우스를 격리실에 넣고, EvF 장치를 준비하고, 양손을 사용하여 프로브를 천천히 들어 올려 표적 조직을 자극한다.
- 쥐가 통각 수용 행동을 표현할 때까지 조직에 가해지는 압력을 점차적으로 높입니다. 오른쪽 뒷발 평가를 위해 발 후퇴, 발 핥기 또는 네 발 점프 2,8,9를 찾으십시오. 내장 평가를 위해 복부의 날카로운 수축, 탐색 부위를 즉시 핥거나 긁는 것 또는 네 발 점프를 찾으십시오 2,11.
- 특정 EvF 프로그램이 포함된 선택한 전자 장치에 데이터를 전송하거나 성적부에 기록하여 얻은 값을 저장합니다. 디스플레이를 0으로 재설정하고 이 과정을 4번 반복하여 5번의 측정8을 얻습니다.
참고: 평균값2를 추정하기 위해 세 개의 유사한 측정값만 고려하십시오. - 각 마우스를 5번 프로브하고 각 동물에 대한 평균값을 얻을 때까지 인접한 챔버에 있는 마우스의 기계적 임계값을 측정합니다.
- 24시간 후에 기준선 측정을 반복하고 평균값이 3.00g 미만이거나 기초 측정 간의 차이가 2.00g 2,8보다 높은 마우스를 제외합니다.
참고: 모든 실험에서 각 마우스에 대해 하나의 표적 조직만 선택해야 하므로 단기간에 평가 횟수가 상당히 많아질 수 있으므로 동물이 프로브되는 데 익숙해지지 않습니다.
5. 실험적 오른쪽 뒷발 및 내장 이질체 기계적 역치 평가
- 0일차 평가를 위해 감염 1시간 후 오른쪽 뒷발 또는 내장 이질소 기계적 임계값을 평가합니다.
- 감염 후 5일 동안 24시간마다 이 절차를 반복합니다.
참고: 투여할 치료법이 있는 경우 실험 설계 내에서 적절한 시점을 선택하십시오. - 동물들이 서로 싸우는 것을 방지하기 위해 쥐를 원래 우리로 되돌려 놓고, 측정이 완료된 후에는 표준 실험실 차우와 물을 이용할 수 있습니다.
- 정규성 검정을 수행하여 데이터의 정규 분포를 확인하고 수집된 데이터에 대한 적절한 통계 분석을 수행합니다.
6. 쥐 찡그린 얼굴 척도 평가
- 격리실 내에서 각 쥐가 쉽게 보이는지 확인하고 실험 전에 각 쥐를 검사하여 팔다리, 복부 또는 얼굴에 병변이 없고 털 변화가 없는지 확인합니다.
- 쥐의 궤도 영역을 관찰하십시오. 눈을 뜨고 있는 것을 통증이 없는 것으로 분류하고(점수 0), 쥐가 눈을 감을 때 명백한 통증이 나타날 수 있습니다(점수 2).
- 쥐의 코를 관찰하십시오. 정상적인 코는 통증이 없는 것으로 분류하고, 콧등에 돌출된 부분이 있으면 명백한 통증을 나타냅니다.
- 쥐의 뺨을 관찰하십시오. 정상적인 뺨은 통증이 없는 것으로 분류하고 양쪽 뺨에 돌출된 부분은 명백한 통증을 나타냅니다.
- 쥐의 귀 위치를 관찰하십시오. 둥근 귀는 통증이 없는 것으로 분류하고 귀는 얼굴에서 멀어지고 뾰족한 모양으로 바깥쪽 또는 뒤로 회전하면 명백한 통증을 나타냅니다. 귀 사이의 공간은 통증 점수에 따라 증가합니다.
- 쥐의 수염을 관찰하십시오. 자연스러운 하향 곡선을 가진 수염은 통증이 없는 것으로 분류하는 반면, 뺨 쪽으로 뒤로 당기거나 앞으로 당긴 수염은 명백한 통증을 나타냅니다.
- 자기 그루밍과 같은 타고난 행동은 얼굴 표정을 방해할 수 있으므로 통증과 관련된 행동으로 간주하지 마십시오8. 모든 작업 단위를 평가하기 전에 마우스가 이 동작을 중지할 때까지 기다립니다.
- 정규성 검정을 수행하여 데이터의 정규 분포를 확인하고 수집된 데이터에 대한 적절한 통계 분석을 수행합니다.
참고: 모든 실험이 끝날 때 마우스는 케타민(90mg/kg)과 자일라진(7.5mg/kg)을 사용하여 복강내로 주입하여 인도적으로 안락사시켰습니다. 확정된 심부 마취 계획에 도달한 후, 그들은 자궁 경부 탈구에 투입되었습니다.
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결과
T. evansi 감염으로 인한 기계적 역치 감소는 오른쪽 뒷발과 내장 조직 모두에 대한 전자 von Frey 장치로 평가되었습니다.
실험은 사용 가능한 T. evansi 샘플2와 관련된 이전 데이터에 따라 5일에 걸쳐 수행되었습니다. 감염된 마우스는 감염 후 3일째에 오른쪽 뒷발의 기계적 역치에서 유의미한 차이를 보이기 시작했으며 감염되지 않은 마우스에 비해 감염 후 2일 동안(그림 1A) 대조군보다 유의하게 낮게 유지되었습니다. 복부 촉각 민감도에 대한 유사한 결과에서는 감염된 마우스에서 내장 이질통이 감염 후 3일째부터 시작하여 감염 후 다음 2일 동안 대조군보다 현저히 낮게 유지되는 것으로 나타났습니다(그림 1B).
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토론
감염된 동물을 대상으로 한 실험에서 중요한 단계는 기생충혈증 수치를 조절하는 것입니다. T. evansi의 다른 균주는 마우스에서 다양한 방식으로 작용할 수 있으며, 급성 감염에서 만성 감염으로 이어질 수있습니다 2,4,5,6. 또한, 감염 용량의 변화는 마우스의 생존 시간을 줄이거나 연장할 수 있다. 따라서, 실험의 정확한 기간을 결정하고 예상치 못한 마우스 사망 사건에 대한 좌절감을 방지하기 위해 실험 전에 생존 곡선을 얻는 것이 권장된다15,16. 또한 이 데이터는 해당되는 경우 실험에 대한 인도적인 종점을 결정할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 재정적 지원을 해준 산타 카타리나 주립대학(Santa Catarina State University), 동물과 우주를 위한 약리학 연구소(Pharmacology Laboratory), 그리고 이 실험에 사용된 T. evansi 에 감염된 혈액 샘플을 냉동 보존한 Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory에 특별한 감사를 표한다.
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재료
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| Trypanosoma evansi cryiop보존 샘플 | UDESC-Sample | , Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory | |
| 에서 양도한 모든 마우스를 감염시키는 데 사용됩니다.범용 유형 10 µ L 폴리프로필렌 팁 | CRALPLAST | 18171 | 전자 장치 폰 프레이 장치에 사용되는 폴리프로필렌, 내장 이질통 평가에 권장 |
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