이 원고는 곰팡이 식물 병원체와의 옥수수 상호 작용에 대한 재현 가능한 세포학적, 생리학적, 분자적 연구를 위해 분리된 옥수수 잎 덮개를 사용하는 최적화된 접종 프로토콜을 자세히 설명합니다. 잎 덮개는 고정되지 않은 조직에서 살아있는 식물과 곰팡이 사이의 세포 상호 작용을 실시간으로 관찰할 수 있도록 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 옥수수 잎 덮개에 hemibiotrophic 및 necrotrophic foliar pathogenic fungi를 접종하기 위한 프로토콜을 최적화했습니다. 이 방법은 원래 벼 잎 덮개에 적용되었던 방법에서 변형되어 살아있는 식물 세포의 곰팡이 성장 및 발달을 직접 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 두 개의 완전히 나온 잎 고리가 있는 옥수수 묘목에서 채취한 잎초는 5 x 105 포자/mL 곰팡이 포자 현탁액의 20μL 방울을 접종하고 연속 형광등 아래에서 23°C의 습도 챔버에서 배양합니다. 24-72시간 후, 과도한 조직을 면도날로 제거하여 표피 세포의 단일 층을 남기며, 화학적 고정이나 투명화 없이 직접 이미지를 얻을 수 있는 광학적으로 투명한 샘플입니다. 식물과 곰팡이 세포는 실험 기간 동안 살아 있으며 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 외피는 감염 및 집락화 중 숙주 및 병원체 세포의 발달 세포학 및 생존력을 연구하기 위해 염색하거나 형질분해를 실시할 수 있습니다. 형광 단백질을 발현하도록 형질전환된 곰팡이 균주는 분리능을 높이고 경쟁적 또는 시너지 상호작용의 평가를 용이하게 하기 위해 외피에 접종하거나 동시 접종할 수 있습니다. 형광 융합 단백질을 발현하는 곰팡이 균주는 planta에서 이러한 개별 단백질의 생산 및 표적화를 추적하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 접종된 수초 조직을 추출하여 핵산, 단백질 또는 대사 산물을 특성화할 수 있습니다. 이러한 외피 분석법의 사용은 옥수수의 곰팡이 병원성 메커니즘과 병원성에 기여하는 곰팡이 단백질 효과기 및 2차 대사 산물의 메커니즘에 대한 자세한 연구를 크게 발전시켰습니다.
서론
세포 수준에서의 공간적 및 시간적 분석은 곰팡이-식물 상호 작용의 생리학 및 세포학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 화학적으로 고정된1,2,3 또는 투명화 및 염색4된 엽면 조직(folar tissue)4과 인공 막(artificial membrane)5은 과거에 엽면 병원균 발달 및 식물-진균 상호작용의 세포학을 조사하기 위해 사용되었다. 그러나 고정이나 투명화 없이 살아있는 숙주 조직의 감염 사건을 실시간으로 조사하는 것은 이미징을 위한 광학적으로 투명한 샘플 준비와 관련된 기술적 문제로 인해 어렵습니다.
분리형 잎집 접종 프로토콜은 1940년대 후반에 벼 돌풍균 Magnaporthe oryza6에 대한 살아있는 벼 표피 세포의 내성에 대한 명시야 현미경 조사를 위해 개발되었습니다. 보다 최근에, Colletotrichum 및 Magnaporthe 종에 의한 숙주 집락화에 대한 상세한 분자, 생리학 ....
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프로토콜
참고: 이 방법의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1: 분리된 옥수수 잎 덮개를 사용한 최적화된 접종 프로토콜의 단계. 포자 현탁액 준비, 잎집 접종 및 살아있는 세포 현미경을 위한 샘플 준비는 각각 녹색(A), 보라색(B) 및 주황색(C) 상자로 강조 표시됩니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 식물 및 곰팡이 물질
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결과
아래 예는 옥수수 잎 외피 접종 방법을 사용한 후의 대표적인 결과를 설명합니다. 이 예는 이 최적화된 분석을 통해 옥수수-곰팡이 상호 작용의 관찰 및 비교를 실시간으로 수행할 수 있는 용이성, 속도 및 정밀도를 보여줍니다. 또한 살아있는 세포 이미징을 통해 정량적 정보를 추출할 수 있어 비교 분자, 세포학 및 생리학적 연구에 유용한 도구를 제공합니다. 자세한 내용은 각 성공적인 출원에 대해 인용된 원본 간행물에서 확인할 수 있습니다.
예제 데이터 1: 곰팡이 상태 평가 및 곰팡이 감염에 대한 식물 반응 감지를 위해 접종된 잎초에서 염색 및 플라스몰분해 사용
옥수수 잎 덮개는 밝은 시야 현미경으로 살아있는 숙주 세포에서 Colletotrichum graminicola 및 Stenocarpella maydis 의 감염 과정을 시각화하고 비교하는 데 사용되어 집락화 패턴과 시간 경과에 대한 자세한 설명이 가능합니다(미.......
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토론
여기에 설명된 최적화된 잎집 접종 방법은 쌀잎집6,8,36을 위해 개발되어 적용된 원래 프로토콜에서 수정되었습니다. 이를 통해 광시야 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 식물 세포의 곰팡이 성장 및 발달을 직접적이고 상세하게 관찰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 옥수수 집락화 중 다양한 미세 현상의 특성화, 비교 및 정량화에 적합하며, 여기에는 양립 대 양립 상호 작용 중 곰팡이 발달 및 숙주 반응이 포함됩니다. Planta에서 특정 곰팡이 단백질의 생산 및 분비; 옥수수-곰팡이 상호 작용 중에 생성된 공통적이거나 새로운 병원성 인자의 세포학 및 생화학. 우리는 옥수수의 hemibiotrophic 및 necrotrophic 병원체와 함께 이 방법을 사용했습니다. 우리는 생물 영양 병원균(예: 녹 곰팡이)에 대한 접종을 시도하지 않았지만 칼집은 살.......
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공개 사항
저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없으며 공개할 것이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 USDA-NIFA의 재정 지원에 감사드립니다(보조금 번호 2018-67013-28489 및 2020-70410-32901). 이 원고에 표현된 모든 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 전적으로 저자의 것이며 미국 농무부의 견해를 반드시 반영하는 것은 아닙니다. 그림 6A 와 그림 7D에 나타난 이미지에 대해 브라질의 방문 학생인 국경 없는 과학의 방문 학생인 Mayara de Silva에게 감사드립니다. 또한 Olympus 컨포칼 현미경에 대한 액세스를 제공한 켄터키 대학의 식물 병리학과에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Axiocam 흑백 현미경 카메라 | ZEISS | 426560-9010-000 | Axioplan 2 현미경과 호환; 라이브 셀 이미징을 위한 낮은 읽기 노이즈와 빠른 속도를 제공 |
| Axioplan 2 에피플루오레센스 현미경 | ZEISS | N/A | 실시간 시청 및 이미지/비디오 캡처 허용 생물학적 샘플 |
| 벤치탑 원심분리기 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; 최대 속도: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| 뚜껑이 있는 Falcon 세균학 페트리 접시 | Fisher Scientific | 08-757-105 | 폴리스티렌 재료; 소수성 표면 |
| 여과지 | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Olympus | N/A | 곰팡이 형질전환체의 시각화를 위해' |
| 발아 종이 | Anchor Paper Co. | SD7615L 76# 플라스틱 상자 축축한 챔버용 중량 | |
| 유리 페트리 접시 | VWR International | 75845-542 | 유형 1 클래스 A, 33 팽창 붕규산 유리; 완전한 세트 (커버 + 바닥), 페트리 플레이트 촉촉한 챔버 |
| 글라스 울 | 오하이오 밸리 스페셜티 케미컬 | 3350 | 유리솜 필터 유닛용 |
| 혈구계/Neubauer 계수 챔버 및 커버 유리 | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm 챔버 깊이; 두 개의 0.4 mm 커버 안경이 함께 제공됩니다 |
| . 현미경 커버슬립 | Fisher Scientific | 12-553-457 | 붕규산 유리; 100/Pk.; 길이 22mm, 너비 22mm |
| 옥수수 품종 골든 주빌리 씨앗 | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | 성숙 95-105 일에서; 시드 유형: F1 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | 미국 과학 | 1415-2500 | 1.5 mL 용량 |
| 현미경 슬라이드 | 피셔 사이언티픽 | 12-550-123 | Superfrost 화이트 탭 슬라이드, 길이 76mm, 너비 25mm |
| 오트밀 한천 (OA) | VWR International | 255210 | Difco 오트밀 한천, BD; 500 g |
| 네일 폴리 | Revlon | 43671 | 투명 네일 폴리시로 현미경 슬라이드를 밀봉; 색상 771 투명 |
| 비스커트 96-웰 PCR 플레이트 | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL 플레이트 볼륨 |
| 페슬 마이크로 원심분리기 튜브용 | USA Scientific | 1415-5390 | 원뿔형 팁; 폴리프로필렌 소재 |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM 물 목표 | Olympus | 1-UB933 | Olympus FV 3000 컨포칼 현미경 |
| 감자 포도당 한천(PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco 감자 포도당 매체, BD; 500g |
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| 단일 가장자리 면도날 | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec 블레이드; 스틸 재질; 38 mm 길이 블레이드 |
| 래치 클로저가 있는 보관 용기/상자 | Target | 002-02-0405 | rmoist 챔버를 위한 투명 시야 보관 상자; 외부 치수: 23 5/8 인치 x 16 3/8 인치 x 6 1/2 인치; 32 qt. 용량 |
참고문헌
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D.
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