Drosophila melanogaster를 사용하여 나이 관련 수면 장애를 위한 High-throughput 작은 분자 약 검열

요약

제시된 것은 노인 초파리 모델에서 초파리 의 수면 행동을 모니터링하여 수면을 개선하기 위한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 프로토콜입니다.

초록

건강과 전반적인 웰빙의 필수 구성 요소인 수면은 수면 시간이 짧아지고 패턴이 단편화되는 수면 장애를 자주 경험하는 노인에게 종종 어려움을 초래합니다. 이러한 수면 장애는 또한 당뇨병, 심혈관 질환 및 심리 장애를 포함한 노인의 다양한 질병의 위험 증가와 관련이 있습니다. 안타깝게도 수면 장애에 대한 기존 약물은 인지 장애 및 중독과 같은 심각한 부작용과 관련이 있습니다. 따라서 새롭고 더 안전하며 효과적인 수면 장애 치료제의 개발이 시급합니다. 그러나 현재 약물 스크리닝 방법의 높은 비용과 긴 실험 기간은 여전히 제한 요인으로 남아 있습니다.

이 프로토콜은 포유류에 비해 수면 조절 메커니즘이 고도로 보존된 종인 Drosophila melanogaster를 활용하는 비용 효율적이고 처리량이 높은 스크리닝 방법을 설명하여 노인의 수면 장애 연구에 이상적인 모델입니다. 늙은 파리에게 다양한 작은 화합물을 투여함으로써 수면 장애에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 파리의 수면 행동은 적외선 모니터링 장치를 사용하여 기록되고 오픈 소스 데이터 패키지인 Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020(SCAMP2020)으로 분석됩니다. 이 프로토콜은 수면 조절을 위한 저렴하고 재현 가능하며 효율적인 스크리닝 접근 방식을 제공합니다. 초파리는 수명주기가 짧고 사육 비용이 낮으며 취급이 쉽기 때문에이 방법의 훌륭한 주제입니다. 예를 들어, 테스트된 약물 중 하나인 Reserpine은 노령 파리의 수면 시간을 촉진하는 능력을 입증하여 이 프로토콜의 효과를 강조했습니다.

서론

인간의 생존에 필요한 필수 행동 중 하나인 수면은 크게 두 가지 상태, 즉 급속 안구 운동(REM) 수면과 비급속 안구 운동(NREM) 수면¹로 나뉜다. NREM 수면은 N1(각성과 수면 사이의 전환), N2(얕은 수면), N3(깊은 수면, 서파 수면)의 세 단계로 구성되며, 각성에서 깊은 수면으로의 진행을 나타냅니다¹. 수면은 신체적, 정신적 건강에 중요한 역할을 한다². 그러나 노화는 성인의 총 수면 시간, 수면 효율, 서파 수면 비율, REM 수면 비율을 감소시킨다³. 나이가 많은 사람들은 서파 수면에 비해 얕은 수면에 더 많은 시간을 보내는 경향이 있어 야간 각성에 더 민감합니다. 각성 횟수가 증가함에 따라 평균 수면 시간이 감소하여 노인의 수면 패턴이 단편화되며, 이는 마우스에서 Hcrt 뉴런의 과도한 흥분과 관련될 수 있다⁴. 또한, 일주기 메커니즘의 노화 관련 감소는 수면 시간의 조기 변화에 기여합니다 ^5,6. 신체적 질병, 심리적 스트레스, 환경적 요인 및 약물 ....

프로토콜

이 프로토콜은 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에서 채취한 30일 된 w¹¹¹⁸ 파리를 사용합니다(BDSC_3605, 자료표 참조).

1. 숙성 초파리의 준비

1. 음식 준비
   1. 콘플레이크 50g/L, 설탕 110g/L, 한천 5g, 효모 25g/L를 섞어 표준 옥수수 전분 배양 배지를 준비합니다. 콘플레이크와 이스트를 물로 가열하여 젤라틴화한 다음 모든 물질을 완전히 녹입니다.
   2. 배지가 50-60°C로 냉각되면 프로피온산 6mL/L를 추가하고 즉시 배양병에 포장합니다.
2. 파리 사육 및 늙은 파리의 준비
   1. 표준 옥수수 전분 배양 배지가 들어있는 병에 파리 균주 w¹¹¹⁸을 사육하고 25 ° C, 68 % 상대 습도, 500-1000 lux 조명 조건 및 12 시간 : 12 시간 빛 : 어두운 사이클의 항온 인큐베이터에 병을 넣습니다.
   2. 파리의 성장 주기에 따라 7일마다 새 병에 파리를 옮겨 넣어 같은 병에 든 개체의 나이를 일정하게 유....

결과

레세르핀(Reserpine)은 수포성 모노아민 수송체(vesicular monoamine transporter, VMAT)의 저분자 억제제로, 모노아민이 시냅스전 소포(presynaptic vesicles)로 재흡수되는 것을 억제하여 수면 증가를 유도한다³³. 레세르핀의 수면 촉진 효과는 생후 30일 된 파리를 대상으로 조사되었으며, 대조군에는 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO)만 먹였습니다. 레세르핀 그룹에서 나이 든 파리는 DMSO 그룹에 비해 낮과 밤 모두 수면이 크게 증가했다. 그림 5A,E는 연속 3일 동안의 Reserpine 및 DMSO 파리의 수면 패턴을 보여주며, 그림 5B-D 및 그림 5F-H<.......

토론

설명된 방법은 중소 규모의 수면제를 신속하게 스크리닝하는 데 적합합니다. 현재 대부분의 주류 고처리량 약물 스크리닝 방법은 생화학 및 세포 수준을 기반으로 합니다. 예를 들어, 수용체의 구조 및 특성을 검사하여 수용체에 결합할 수 있는 특정 리간드를 검색한다⁽²²). 또 다른 접근법은 질량 분석법(³⁵)과 함께 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 선택된 약물의 분자 단편의 결합 모드 및 강도를 분석하는 것을 포함한다. 그러나 이러한 방법은 스크리닝 오류율이 상대적으로 높은 경우가 많으며, 이를 통해 선택된 약물은 동물 실험이나 임상 실험에서 효과가 없는 경우가 많습니다. 체내 약물의 효능은 약물 흡수, 분포, 신진대사, 배설 등 다양한 요인에 의해 영향을 받아 오검사율이 높습니다. 대조적으로, 우리가 제안한 방법은 고처리량 방법에 비해 스크리닝 규모가 작지만 표현형에 대한 약물 효과를 직접 관찰함으로써 보다 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 제.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ager	BIOFROXX	8211KG001
인공 기후 상자	PRANDT	PRX-1000A	공식 웹사이트:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 초파리 활동 모니터	TriKineics	DAM2	공식 웹사이트:https://www.trikinetics.com/
DAM2system	TriKineics	버전:v3.03	공식 웹사이트:https:// www.trikinetics.com/
DAMFileScan	TriKineics	버전:1.0.7.0	공식 웹사이트:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide	SIGMA	276855
초파리 활동 모니터링 인큐베이터	Tritech Research	DT2-CIRC-TK	공식 웹사이트:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles	Biologix	51-17720	공식 웹사이트:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
초파리: w1118	Bloomington Drosophila Stock Center
Excel	Microsoft	버전:Excel 2016	공식 웹사이트:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
유리관	TriKinetics	PPT5x65	공식 웹사이트:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b	MathWorks	버전:9.13.0.2049777	공식 웹사이트:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism	GraphPad	버전:Prism 8.0.1	공식 웹사이트:https://www.graphpad.com/features
Reserpine	MACKLIN	R817202-1g
Saccharose	SIGMA	1245GR500
SCAMP	Vecsey Lab	N/A	공식 웹사이트:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

BDSC_3605